[发明专利]单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用。

背景技术

神经节苷脂(ganglioside，Gls)是一类含唾液酸的膜糖脂/鞘糖脂，由亲水的寡糖链和亲脂的神经酰胺两部分组成。神经节苷脂位于神经元细胞的双层结构外层，为大多数哺乳动物细胞膜的组成成分和大脑形成记忆的重要物质，因其最早被发现于神经节细胞而得名。

单唾液酸四己糖神经节苷脂（Monosialotetrahexosylganglioside，GM1）为乳白色粉末，无味，有吸湿性，分子量为1551（GM1钠盐的分子量为1574），溶于水、甲醇-水、甲醇-氯仿，不溶于甲醇、丙酮、氯仿、乙醚，熔点为207-230℃，其紫外吸收最大波长位于205nm，可通过氨基正相高效液相色谱和薄层色谱（TLC）进行纯度鉴定，气相色谱可鉴定GM1分子中的糖基和神经酰胺残基。

能嵌入神经细胞膜，模仿内源性神经节苷脂的某些功能，调节膜介导的细胞功能，并刺激中枢神经系统损伤后潜在的代替机制而阻止损害的发生，保护未受损的神经组织，还能影响体外培养的神经元生长及其活性，促进其存活及生长。神经节苷酯GM1在神经系统的主要生理作用包括：1）促进神经细胞的生长、分化发育和神经再生；2）参与突触传递，维持脑的正常机能，参与各种记忆活动；3）在细胞与细胞、细胞与微生物、细胞与基质间的相互作用中起到介导作用；4）调节细胞膜中各种蛋白质功能，如离子通道、表皮生长因子受体等。

能通过血脑屏障，注射后快速在大脑和脊髓组织中分布，临床治疗效果十分显著，主要用于治疗血管性中枢神经系统疾病或创伤性中枢神经系统疾病，如脑卒中、脊髓损伤、脑外伤、各种慢性病后期的神经功能障碍、脑萎缩、阿尔茨海默病、帕金森氏病、脑血管意外、智力障碍等。意大利Fidia公司从牛脑组织中提取的GM1注射液（商品名Sygen）已于20世纪90年代在我国销售。

哺乳动物脑组织中主要包括GM1、GD1a、GD1b和GT1b等神经节苷脂成分。这些成分中的寡糖链和神经酰胺部分结构一致，主要差异在于寡糖链上唾液酸分子的位置和数量。其中，GD1a和GD1b的糖链上有两个唾液酸，但各自位置不同；GT1b的糖链上有三个唾液酸；GM1的糖链上有一个唾液酸。GD1a、GD1b和GT1b寡糖链上的唾液酸基团在酸性或酶催化条件下可降解，进而制得GM1。

公开了单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，该方法使用混合溶剂（氯仿：甲醇：水的体积比为1:2:0.75）从哺乳动物脑组织中提取总神经节苷酯，浓缩总神经节苷酯提取液后再进行酸水解（pH3.0-5.0）以提高GM1含量，浓缩水解产物经脱盐后溶解于混合溶剂（氯仿：甲醇：水的体积比为1:2:1.4）中进行阴离子交换柱层析（如Q-Sepharose F.F.或DEAE- Sepharose），其中，脑组织与混合溶剂的体积比为1：20，收集含GM1的洗脱峰，浓缩后再进行反相柱层析（SourcRPC30），所得GM1于冷丙酮中沉淀，收集沉淀，干燥，即得。该文献报道的GM1纯度大于98%，但存在操作复杂、制造成本高，难于工业化生产等缺陷。

目前，GM1主要来源于动物脑组织，从动物脑组织中提取总神经节苷酯混合物的方法业已成熟稳定，GM1产率的增加关键在于提高神经节苷脂混合物中其他神经节苷脂转化为GM1的转化率。多采用微生物转化法和无机酸转化法来提高神经节苷脂GM1的产率。微生物转化法是从土壤中筛选培养具备降解唾液酸活性的微生物菌落，使其与神经节苷脂混合物共同发酵培养，微生物在代谢过程中表达一种具备唾液酸降解活性的蛋白酶，专一高效地实现神经节苷脂的转化。然而，天然微生物在与神经节苷脂共同孵化培育过程中，会产生大量的菌体异源蛋白质和异源DNA，进而导致严重的用药安全隐患。无机酸转化法则在神经节苷脂混合物溶液中加入盐酸、硫酸或磷酸，调节pH值至3.0-5.0，保温反应，即可。该方法操作简单，所用化学试剂安全可靠，普遍用于GM1的生产。然而，该方法存在由神经节苷脂转化为GM1的效率不理想，实际转化率仅有理论转化率的60％左右，约有40％的GM1被过度酸化为脱唾液酸神经节苷脂GA1。