[发明专利]一种海洋微生物来源的低温β―半乳糖苷酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种海洋微生物来源的低温β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶（学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactoside galatohydrolase,EC3.2.1.23）是一种可以特异性的水解β-1,4-糖苷键的水解酶，可以将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，同时也具有半乳糖苷转移的作用。

β-半乳糖苷酶广泛存在于自然界的生物体中，如植物、细菌、真菌（米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母）、放线菌以及动物肠道（特别是婴儿肠道）中。

从催化的反应来看，β-半乳糖苷酶属于糖基水解酶（glycosyl hydrolase，缩写为GH），依据其序列与结构的不同，β-半乳糖苷酶又分为四个家族，分别是GH1，GH2，GH35和GH42家族。

乳糖是哺乳动物乳汁中一种特有的二糖，在人乳中约含7%，牛乳中约含5%。乳汁进入体内后，主要由存在于人体小肠内皮细胞绒毛膜刷状缘表面的β-半乳糖苷酶将其中的乳糖分解成半乳糖和葡萄糖后吸收。若体内缺失β-半乳糖苷酶，或由于年龄的增长，β-半乳糖苷酶的活性降低，将会使乳汁中过多的乳糖存留于肠道不被吸收，导致肠道渗透压不平衡，多余的水分无法被大肠吸收而造成水状腹泻，称为乳糖不耐症。成年黄种人中乳糖不耐症的发病率较高，影响了牛奶中营养成分的吸收。

解决乳糖不耐症的主要方法是在牛奶生产时添加外源性的β-半乳糖苷酶，使其中的乳糖部分或完全地水解，可有效地缓解乳糖不耐症。目前仅来源于微生物的β-半乳糖苷酶有工业应用价值，因利用微生物发酵法制取β-半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本低，生产周期短，而且不受季节、地理位置等因素的影响。酵母菌和霉菌是目前工业化生产β-半乳糖苷酶的主要来源，对它们的研究也比较深入。目前已经应用于牛奶加工业的β-半乳糖苷酶有来自荷兰DSM公司的克鲁维酵母菌，该酶分子量135kDa，最适pH为pH6.8，与新鲜牛奶的天然pH相近；但是该酶有一些显著的缺点，如该酶的pH稳定范围较窄，在pH大于7.0或者小于pH6.2均迅速失活；最适作用温度较高，为45°C，低温下的活性较低，且Ca²⁺对其酶活具有显著抑制作用，这些缺点，均极大地限制了其在乳制品行业中的应用。

海洋的生态环境与陆地不同，具有高盐、高压力、低温和温度变化缓慢的特点。来源于海洋微生物的酶往往具有特殊的酶学性质，例如作用温度低以及对金属离子耐受等，该类型的β-半乳糖苷酶就是其中一种值得开发的酶。

本申请人已将从东海海域的海水中培养分离得到的一株海洋盐单胞菌（Halomonas sp.）菌株P6009-1于2011年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCC No:M2011001；并于2011年1月27日申请了中国发明专利CN201110029078.2并获得授权，发明名称为“一株产低温β-半乳糖苷酶的海洋盐单胞菌及其应用”，公布号为CN102174439A。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海洋微生物来源的低温β―半乳糖苷酶及其制备方法，本发明的另一目的是提供该β―半乳糖苷酶的编码基因，以及该β-半乳糖苷酶在分解牛奶乳糖中的应用。

本发明的第一方面，对海洋盐单胞菌（Halomonas sp.）菌株P6009-1进一步地研究，是提供一种海洋微生物来源的低温β-半乳糖苷酶（P6009-BGalH），是用以下方法制备得到的，该方法包括以下步骤：

（A）Halomonas sp.P6009-1的发酵

将Halomonas sp.P6009-1菌种（保藏号为CCTCC No:M2011001）接种于Zobell 2216E液体培养基，28℃，摇床振荡（130rpm）培养24h进行活化，取500μL活化好的菌液接种于100mL的含2%乳糖的Zobell 2216E培养基中，28℃，130rpm振荡培养4d；