[发明专利]一种海洋微生物来源的低温β―半乳糖苷酶及其编码基因与应用

权利要求书

1.一种海洋微生物来源的低温β-半乳糖苷酶，其特征在于，该酶是用以下方法制备得到的： 

（A）Halomonas sp.P6009-1的发酵 

将Halomonas sp.P6009-1菌种（保藏号为CCTCC No:M2011001）接种于Zobell2216E液体培养基，28℃，130rpm摇床振荡培养24h进行活化，取500μL活化好的菌液接种于100mL的含2%乳糖的Zobell2216E培养基中，28℃，130rpm振荡培养4d； 

所述的Zobell2216E液体培养基配方为：蛋白胨5g，酵母粉1g，磷酸铁0.1g，溶于1L人工海水，pH7.4；所述的人工海水的配方为：NaCl25.0g，Na₂SO₄4.0g，KCl0.7g，NaHCO₃0.20g，KBr0.10g，H₃BO₃0.03g，NaF0.003g，53mL1.0mol/L MgCl₂溶液，10mL1.0mol/l CaCl₂溶液，0.90ml0.1mol/L SrCl₂溶液，蒸馏水1000ml； 

（B）粗酶液的制备 

发酵结束后，发酵液离心取菌体，将菌体重悬于磷酸缓冲液，冰浴条件下用超声波粉碎机破碎细胞，破菌后的菌液离心取上清为粗酶液； 

（C）低温β-半乳糖苷酶的纯化 

将步骤（B）所得到的粗酶液10ml，加入2.2g的(NH₄)₂SO₄进行盐析。离心取上清再加入0.6g的(NH₄)₂SO₄进行第二次盐析，离心取沉淀。加入3mL的含1mmol/L MgCl₂、pH7.2的0.1mol/L K₂HPO₄-KH₂PO₄重悬沉淀，HiPrep ^TM26/10脱盐柱除盐，收集目的蛋白；进一步取2mL上样于PABTG亲和柱，用15%的含0.5mol/L KCl、0.1mol/L乳糖、1mmol/L MgCl₂、pH7.2的0.1mol/LK₂HPO₄-KH₂PO₄的buffer B缓冲液洗脱60min，接着用20%的buffer B缓冲液洗脱20min，流速为1mL/min；将经亲和层析纯化后浓缩、置换缓冲液后的活性组分上样2mL于Capto DEAE弱阴离子交换柱，用0%~100%的含1mol/LKCl,1mmol/L MgCl₂,pH7.2的0.1mol/LK₂HPO₄-KH₂PO₄的buffer C缓冲液梯度洗脱40min，流速为1mL/min，检测波长为280nm和214nm；活性组分再经Capto Q强阴离子交换柱、Sepharcryl S200分子筛进一步分离后，获得电泳纯的P6009-BGalH，分别进行SDS-PAGE和非变性-PAGE，发现其分子量约为90kDa，亚基大小为48kDa左右。 

2.一种海洋微生物来源的低温β-半乳糖苷酶，其特征在于，该酶是如下（a）或（b）或（c）的蛋白质： 

（a）由序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 

（b）将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残疾的取代和/或缺失和/或添加且与β-半乳糖苷酶相关的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白质； 

（c）将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在N端或C端加上一段序列，且与β-半乳糖苷酶相关的由SEQ ID NO:2衍生的序列。 

3.一种如权利要求2所述的海洋微生物来源的低温β-半乳糖苷酶的编码基因，其特征在于，编码基因为如下(ⅰ)或(ⅱ)的DNA分子： 

(ⅰ)其编码序列是序列表中SEQ ID NO:1所示的DNA分子； 

(ⅱ)在严格条件下与(ⅰ)限定的DNA序列杂交且编码所述β-半乳糖苷酶的DNA分子。