[发明专利]一种CEA阳性肿瘤特异性树突状细胞疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域。具体涉及了一种腺病毒载体介导癌胚抗原CEA抗原肽基因转染制备CEA阳性肿瘤特异性树突状细胞疫苗的方法。

背景技术

胃癌和大肠癌是目前我国发病率很高的恶性肿瘤，胃癌占消化道恶性肿瘤的第一位，大肠癌发病率已经上升到第四位。目前大肠癌，胃癌首选的有效治疗方法仍是手术切除，但切除率较低，复发转移较高。术后综合治疗以放疗，化疗为主，但毒副作用大，患者往往难以接受。因此，胃癌和大肠癌预后欠佳，需要寻找新的更有效的治疗方法。

随着科学的不断进展，肿瘤的生物治疗异军突起，已经成了继手术，放疗，化疗后的第四大肿瘤治疗技术，在改善患者生存质量，降低复发率方面的重要作用已经得到越来越多的认可和重视。树突细胞(dendritic cells, DC)是人体内功能最强大的专职抗原呈递细胞(antigen process cells，APC)，能诱导出抗原特异性细胞毒T 淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL) 反应，在人体抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用。DC细胞表面的MHC分子可以和肿瘤抗原结合，然后递呈给T细胞，诱导T细胞活化，激活初始免疫应答，在体内发挥免疫监视功能。因此自从DC强大的递呈抗原功能被发现以来，就得到了人们的广泛关注，目前国内外围绕以DC为核心的抗肿瘤免疫治疗研究积累了大量的经验。不过尽管以DC为基础的免疫治疗副作用轻微，能诱导出一定的抗肿瘤免疫反应，多数研究所获得的临床效果还是有限。

癌胚抗原（CEA）是一种广为人知的广谱肿瘤标志物。最早是在1965年由加拿大学者Gold和Freedman首先从胎儿结肠及结肠癌的提取物中发现，在多种类型的肿瘤上都有表达。人们把有CEA表达的肿瘤称为CEA阳性肿瘤，CEA阳性肿瘤包括90%以上的胃癌，肠癌，胰腺癌，70%以上的非小细胞肺癌等，目前临床上常把CEA作为大肠癌和消化道恶性肿瘤的辅助诊断指标。CEA在正常组织、癌组织和胚胎中表现出复杂的表达模式，尤其是CEA表现出选择性的上皮细胞表达。尽管CEA在一些正常组织中也有微量存在，但它在肿瘤组织中的表达远远高于正常组织。因此CEA是一种比较理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活机体免疫系统产生针对CEA的免疫应答，故而人们一直寻求多种途径增强CEA的免疫原性。

癌胚抗原（CEA）是一种广为人知的广谱肿瘤标志物。最早是在1965年由加拿大学者Gold和Freedman首先从胎儿结肠及结肠癌的提取物中发现，在多种类型的肿瘤上都有表达。人们把有CEA表达的肿瘤称为CEA阳性肿瘤，CEA阳性肿瘤包括90%以上的胃癌，肠癌，胰腺癌，70%以上的非小细胞肺癌等，目前临床上常把CEA作为大肠癌和消化道恶性肿瘤的辅助诊断指标。CEA在正常组织、癌组织和胚胎中表现出复杂的表达模式，尤其是CEA表现出选择性的上皮细胞表达。尽管CEA在一些正常组织中也有微量存在，但它在肿瘤组织中的表达远远高于正常组织。因此CEA是一种比较理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活机体免疫系统产生针对CEA的免疫应答，故而人们一直寻求多种途径增强CEA的免疫原性。

目前肿瘤的基因治疗也已经成了一个热点。腺病毒是一种DNA双链无包膜病毒，基因组为36kb，基因背景清楚，在美国应用多年，证明对人体是无害的。腺病毒载体以其宿主范围广，转染效率高，不整合到宿主基因组中，仅瞬时表达，安全性高，易制备高滴度腺病毒等优点而成为人类基因治疗中最理想的病毒载体之一。一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体称为第一代腺病毒载体，E1基因缺失丧失复制能力，但可以在E1补偿细胞如293细胞中复制。

发明内容

针对现阶段应用常规方法所诱导的DC细胞受肿瘤免疫抗原性强度影响大，免疫激发力较弱等方面的不足。本发明提供了一种腺病毒载体介导癌胚抗原CEA抗原肽基因转染制备DC细胞疫苗的方法，使获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗具有更强的免疫激发能力，并且不需要制备肿瘤抗原，让DC疫苗的制备不再受肿瘤细胞来源较少，抗原蛋白成本较高的限制。

为实现上述目的，设计一种一种CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，该方法由以下步骤组成：

a.构建载有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重组腺病毒AD-CEA；

b.分离和培养DC细胞；

c.采用重组腺病毒AD-CEA转染DC细胞，获得CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC。