[发明专利]一种CEA阳性肿瘤特异性树突状细胞疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：

a. 构建载有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重组腺病毒AD-CEA；

b. 分离和培养DC细胞；

c. 采用重组腺病毒AD-CEA转染DC细胞，获得CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC。

2.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤 (a) 包括如下工艺步骤：

a1：将载有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染293细胞，培养至出毒，得到原代毒种；

a2：用原代毒种感染293细胞，待2-3天细胞病变后，进行浓缩纯化，获得扩增后的重组腺病毒AD-CEA。

3.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤 (b) 中的DC细胞包括下列细胞：外周血单个核细胞培养的DC细胞，骨髓来源的DC细胞，脐带血来源的DC细胞。

4.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤 (c) 包括如下工艺步骤：

c1：采用步骤 (a) 中制备的重组腺病毒AD-CEA病毒液感染步骤 (b) 中制备的DC细胞；

c2：采用含有GM-GSF和IL-4的完全培养液，于37℃，5%CO2的培养箱中继续培养步骤 (c1) 中感染后的DC细胞；

c3：到第5天，在步骤 (c2) 中培养的DC细胞中加入TNF-α，继续培养3天，第8天获得的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗AdCEA-DC，光镜下形态学鉴定，并用流式细胞仪检测细胞表型CD1a，CD80，CD83，CD86，HLA-DR。

5.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于：步骤 (a) 中所述的重组腺病毒AD-CEA是Ad2或Ad5血清型的腺病毒，该病毒缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了癌胚抗原CEA抗原肽基因表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列，癌胚抗原CEA抗原肽基因编码序列，聚腺苷酸信号序列。

6.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于：步骤 (a) 中所述的癌胚抗原CEA抗原肽的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于：步骤 (c) 中获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC，是通过腺病毒为载体将癌胚抗原CEA抗原肽基因转入DC细胞中获得的，可以表达癌胚抗原CEA抗原肽基因。

8.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于：步骤 (c) 中用来感染DC的重组腺病毒AD-CEA的使用MOI值为50-1000。

9.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于：步骤 (c) 中获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC，CEA抗原肽基因阳性表达率在20%-100%。

10.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于：步骤 (c) 中获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC可诱导出对CEA表达阳性肿瘤细胞有特异性杀伤作用的CTL。