[发明专利]一种改进的腺病毒载体系统及其病毒颗粒的制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种改进的腺病毒载体系统及其病毒颗粒的制备和应用。

背景技术

腺病毒(adenovirus,Ad)作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初，当时病毒学家观察到腺病毒基因组可与猴类病毒40（SV40）基因组杂交，说明腺病毒基因组可承载异源性基因。此后腺病毒逐步发展成一种重要的载体系统。

腺病毒载体的特点是转基因效率高，体外实验通常有超过90％的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。因而，腺病毒载体在基因治疗临床试验方面有了越来越多的应用，成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。目前运用最广的腺病毒载体是血清5型腺病毒。

目前构建重组腺病毒系统的策略主要有细胞/细菌中重组法和体外直接重组法两种。前者以Stratagene公司的Ad-easy系统为代表，重组反应在细胞或细菌体内进行，需要繁琐的筛选步骤，才能获得正确的重组载体；后者应用体外重组法，以Clontech的Adeno-X系统和Invitrogen公司的Virapower系统为代表。Adeno-X系统采用两次酶切连接方法，但是第二次连接时由于病毒基因组较长（大于36K），成功率低，且试剂盒价格昂贵。Invitrogen公司的Virapower系统使用了两次重组的方法在体外完成重组载体，但两种重组需要两种重组酶，成本很高，且重组酶对温度敏感，常常导致重组效率出现不稳定。

体外重组完成的载体在包装病毒前，一般需要进行PacI酶切，并采用经典的酚：氯仿：异戊醇纯化，该方法耗时长，回收效率不高，且对操作者有化学危害的风险。

为使腺病毒系统1）在载体构建过程中，达到高效且减少不稳定性，减低试剂成本；2）在完成构建酶切后的纯化过程中，既能提高纯化回收率，又能避免有毒化学试剂的使用，我们改进了腺病毒载体系统及酶切后的纯化方式，提高了效率，降低了成本，获得了很好的病毒颗粒制备效果。

发明内容

本发明目的是提供一种改进的腺病毒载体系统和病毒制备方法，该系统结合了酶切连接和重组反应技术，既能高效构建载体，又降低了试剂成本；本发明的另一目的是提供后续病毒载体酶切后，纯化的一种改进方法，该方法摒弃了传统的酚：氯仿：异戊醇方法，而使用常规的DNA回收柱或直接加热灭活法，简单易行，提高了效率，利用这两个方面结合起来的腺病毒系统，制备效率提高，成本降低。

本发明的技术方案如下：

本发明目的是提供一种改进的腺病毒载体系统和病毒制备方法，该系统结合了酶切连接和重组反应技术，既能高效构建载体，又降低了试剂成本；本发明的另一目的是提供后续病毒载体酶切后，纯化的一种改进方法，该方法摒弃了传统的酚：氯仿：异戊醇方法，而使用常规的DNA回收柱或直接加热灭活法，简单易行，提高了效率，利用这两个方面结合起来的腺病毒系统，制备效率提高，成本降低。

本发明的技术方案如下：

本发明的技术方案之一是：一种腺病毒载体系统，它是以pDONR221载体为初始载体进行改进，插入了多克隆位点和IRES-GFP片段。

其中，优选的，所述的多克隆位点依次为：NotI，XbaI，BglII,，XhoI，SacI，EcoRI，PstI，SalI，SacII，SmaI，BamHI。

本发明以Invitrogen公司载体pDONR221中骨架部分为起始，连接上多克隆位点和IRES-GFP片段，使载体能高表达目的基因，同时又有GFP蛋白为示踪，克服了原来载体中没有GFP示踪蛋白的缺陷。

在设计多克隆位点时，充分评估了载体上其它序列信息，加上单一酶切位点：NotI，XbaI，BglII,，XhoI，SacI，EcoRI，PstI，SalI，SacII，SmaI，BamHI，有利于用简单的酶切、连接的方法进行克隆。酶切位点的序列信息如下：

5'-GCG GCC GCT TCT AGA CTC AGA TCT CGA GCT CAA GCT TCG AAT TCT GCA GTC GACGGT ACC GCG GGC CCG GGA TCC-3'。

其中，优选的，所述的腺病毒载体，由包括以下步骤的方法制备而得：

1）取pIRES-EGFP载体为模板，采用以下两条引物进行PCR扩增，获得MCS-IRES-GFP片段，所述的引物中，一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,另一条引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；