[发明专利]一种改进的腺病毒载体系统及其病毒颗粒的制备和应用

权利要求书

1.一种腺病毒载体，其特征在于，它是以pDONR221载体为初始载体进行改进，插入了多克隆位点和IRES-GFP片段。

2.如权利要求1所述的腺病毒载体，其特征在于，所述的多克隆位点依次为：NotI，XbaI，BglII,，XhoI，SacI，EcoRI，PstI，SalI，SacII，SmaI，BamHI。

3.如权利要求1所述的腺病毒载体，其特征在于，所述的腺病毒载体由包括以下步骤的方法制备而得：

1）取pIRES-EGFP载体为模板，采用以下两条引物进行PCR扩增，获得MCS-IRES-GFP片段，所述的引物中，一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,另一条引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；

2）将步骤1）所述的MCS-IRES-GFP片段与载体pDONR221进行BP重组，获得的载体pDONR-MCS-IRES-GFP；

3）将载体pDONR-MCS-IRES-GFP和载体pAd/CMV/V5-DEST进行LR重组，获得最终载体pAd/MCS-IRES-GFP。

4.如权利要求3所述的腺病毒载体，其特征在于，所述的BP重组使用Invitrogen的BP重组系统进行BP重组；所述的LP重组使用Invitrogen的LR重组系统进行LR重组。

5.一种重组腺病毒载体，其是在权利要求1所述的腺病毒载体的多克隆位点插入了外源基因片段的重组腺病毒载体。

6.一种如权利要求5所述的重组腺病毒载体包装病毒的方法，包括将重组腺病毒载体线性化后转染293A细胞，其特征在于，包括：

1）将如权利要求5所述的重组腺病毒载体用PacI限制性内切酶进行酶切反应；

2）将步骤1）所得的酶切反应液纯化并回收酶切产物应用于转染；或者将步骤1）所得的酶切反应液升温灭活，然后直接应用于转染。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述的重组腺病毒载体的用量是0.01-1μg/μl，PacI酶的用量为0.01-1U/μl；步骤2）中所述的升温灭活在温度65℃，保温时间20分钟。

8.如权利要求1所述的腺病毒载体在基因克隆或表达中的应用。