[发明专利]一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法

说明书

技术领域

本发明提供一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，属于生物技术领域一种电泳凝胶染色方法，可使同一块胶上的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时显色。 

背景技术

γ-PGA是微生物产生的细胞外阴离子型多聚氨基酸，是某些细菌荚膜的主要组分。1937年，Ivnoavics在Bacillus anthracsi的荚膜中首次发现γ-PGA。γ-PGA由D型谷氨酸(D-Glu)和L型谷氨酸(L-Glu) 通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物。γ-PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，基本骨架呈直链纤维状。一般而言，由芽孢杆菌发酵产生的γ-PGA的平均分子量(Mw)在100-1000kD之间。γ-PGA的结构与蛋白质相似，但是与蛋白质相比较，存在以下不同之处：（1）蛋白质的组成成分较为复杂，由20多种氨基酸组成，而γ-PGA仅仅包括谷氨酸一种单体；(2)蛋白质的生物合成是以DNA为模板，通过转录、翻译等过程形成的，γ-PGA的生物合成主要通过其特定的合成酶系催化反应得到，无需以DNA为模板的转录翻译过程；(3)蛋白质具备特定的生物学功能，不同蛋白质的功能各异，而γ-PGA没有特定的生物学功能，其功能较为广泛；（4）蛋白质具有特定的分子量，γ-PGA的分子量较为分散，其范围从l00KD到1000KD不等。 

γ-PGA具有很好的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性、生物降解性、吸水性等特性，这些特性使γ-PGA具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、缓释、助溶和粘结等许多功能。是一种具有良好生物相容性、生物可降解性和较强的亲和性的新型高分子材料，具有广阔的应用前景和经济价值。主要应用在：（1）医药领域，可以延长、改善、控制药物释放，作为抗癌药物载体、肝细胞及外用药物载体和靶向给药系统，作为可生物降解的粘合剂、止血剂等；（2）农业领域，作为土壤植物的保水剂、农药和肥料的缓释剂等；（3）食品领域，维持食品外形和延长货架期、食品冷藏防冻剂、苦味掩盖剂和除涩剂、矿质吸收促进剂等；（4）化妆品领域，皮肤润滑剂、头发定型剂、保湿因子等；（5）环保领域，作为吸附金属和放射性物质、絮凝剂等。 

有关γ-PGA的定量分析，以前的报道通常是采用冻干后称重的方法。分子量特别大的γ-PGA (>1000 000KD)，可测定十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )条带染色后的光密度确定浓度或采用凝胶渗透色谱(GPC)和折射监测器测定。Kanno和Takamatsu建立了一种使用溴化十六烷基三甲基胺显色法定量测定枯草芽孢杆菌γ-PGA的简单分光光度法。另外，也有采用将发酵液离心除菌后，取上清液按常规方法酸水解，然后用氨基酸分析仪或高效液相色谱等方法测定水解前后谷氨酸的含量，两者之差即为聚谷氨酸的量。另外核磁共振仪或傅里叶红外光谱仪等也有应用。 

在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质等生物大分子能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了原有的电荷差别，使生物大分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与所带的电荷无关，在一定条件下，分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。  

发明内容

一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法。其特征在于采取如下步骤：（1）制备蛋白质和γ-聚谷氨酸电泳样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，（2）将电泳后的胶进行固定和考马斯亮蓝R250染色液初染并脱色，直至蛋白质条带清晰，（3）将初染后的胶放入亚甲基蓝染液进行复染并脱色，直至蛋白质和γ-聚谷氨酸条带清晰。 

所述的一种凝胶电泳的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于步骤（1）中，将分离纯化后的蛋白样品和γ-聚谷氨酸样品用蒸馏水制成适当浓度的水溶液，加入等量2x凝胶加样缓冲液，沸水浴5 min，即为电泳样品。根据蛋白和γ-聚谷氨酸样品特点选择电泳胶浓度和电泳条件进行电泳。 

所述的一种凝胶电泳的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于步骤（2）中，胶板用固定液固定0.5-3 h，加入考马斯亮蓝R250染色液，根据胶的厚度，在水平摇床上染色约1-5 h，将胶板取出用脱色液脱色至条带清晰。 

所述的一种凝胶电泳的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于步骤步骤（3）中，将初染脱色后的胶放入亚甲基蓝染色液中染色1-3 h，再放入3%乙酸脱色液或蒸馏水中脱色至条带清晰。