[发明专利]一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法，属于生物技术领域一种分离功能蛋白的技术。

背景技术

蛋白是细菌和古细菌编码的一种高度保守的蛋白，大肠杆菌的Dps于1992年首先被发现，目前在例如无害李斯特氏菌（Listeria innocua）、乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、耻垢分支杆菌（Mycobacterium smegmati s）等几乎所有被检测的细菌中均已发现Dps家族蛋白，超过一千种Dps类蛋白已经被确定 (http://www.uniprot.org)。它们当中接近97% 在细菌中发现，剩余的 3%在古细菌中，但不存在于动物和人中。

Dps蛋白的结构信息也不断增加(http://www.rcsb.org), 揭示了整个蛋白家族的高度保守型。大肠杆菌Dps单体由167个氨基酸构成，分子量接近20KD，形成5个α-螺旋二级结构；活性结构为十二聚体，由12个单体形成了一个直径9nm、内腔直径4.5nm、近似球形中空的六面体结构颗粒（Nat Struct,Biol, 5:294-303,1998）。Dps蛋白每2个单体形成一个二聚体，一个二聚体形成一个面，形成二聚体的两个单体作用界面处含有两个铁氧化酶活性位点，共计12个铁结合位点。Fe(II)离子经氧化后转移到球体中空内腔，每个十二聚体的活性Dps能够结合约450-500个铁，形成Dps结合铁,当细菌需要铁时再以Fe(II)离子形式释放到细胞质溶液中供细菌利用。

在逆境胁迫条件如恶劣的生存环境、营养缺乏或药物作用时，Dps蛋白大量表达，十二聚体的Dps将通过生物晶体化（biocrystallization）方式聚集，能够在菌体内结合Fe(II)离子防止其通过芬东反应氧化产生自由基；能催化Fe(II)和Fe(III)的转化，防止Fe(III)因沉淀导致的毒性；与DNA非特异结合并保护DNA分子，防止DNA分子的氧化损伤。除此之外，Dps一类的蛋白展示出除抗氧化保护作用和DNA结合功能能之外的多种活性，Dps家族的成员可以作为毒力因子保护细胞抵抗冷激热激、金属胁迫，甚至与炎症过程有关（Rendiconti Lincei,19:261-270,2008)。鉴于Dps蛋白的结构和功能特点，其在生物技术和纳米技术领域将有广泛的应用前景。

纳米材料是指在三维空间上至少有一维尺度小于100nm的材料。纳米材料由于尺寸很小，结构特殊，具有与传统材料不同的理化特性，如小尺寸效应，量子效应，巨大表面比效应，量子隧道效应等。这些特性使纳米材料被广泛应用到药物载体，杀菌，食品保鲜，化妆品，涂料、服装制造等众多领域，这使人们有更多的机会直接接触到纳米材料。纳米银是由银制备的纳米材料，纳米银颗粒与生物大分子存在作用，特别是它巨大的表面比特性能吸附大量的蛋白质（Adv. Colloid Interface Sci. 167:134–135，2007），而这种吸附又是造成蛋白活性改变，影响生理机能的重要机制。纳米银具有杀菌、抑菌作用，其机制可能是通过细菌DNA损伤、活性氧自由基的氧化损伤、脱氢酶失活、菌体内溶物泄漏和中断细胞信号转导等机制发挥的作用（食品科学,17:420-424,2010），但还缺乏深入的实验证据支持。

目前有关纳米银与Dps蛋白之间的相互作用尚未见有报道。但是对Dps蛋白的应用已有研究，国内相关专利有“用于疫苗和诊断学的Dps蛋白（专利申请号201080060432.1）”，提供了一种新型Dps融合蛋白，其包含与Dps蛋白融合的蛋白或肽，可应用于疫苗、诊断试剂等领域。

发明内容

本项发明专利的意义在于通过纳米银与Dps结合从菌体大量可溶性菌体蛋白成分中浓缩分离Dps蛋白，整个方法简便快捷。

一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法，其特征在于采取如下步骤：（1）菌体培养和破碎，获得可溶性菌体蛋白溶液，（2）在菌体可溶性蛋白溶液中加纳米银，（3）将溶液进行高速离心，收集沉淀，Dps与纳米银结合后被离心到沉淀中。

步骤（1）中，将菌体在液体培养基中培养至静止期，然后将菌体进行超声波破碎或反复冻融破碎，10 000rpm 离心10-20分钟，取上清，此为菌体可溶性蛋白溶液。

步骤（2）中，在菌体可溶性蛋白溶液中加入纳米银，至纳米银浓度为5-500ppm。25-37℃条件下震荡30分钟。