[发明专利]一种水蛭肽和制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于多肽及其制备领域，特别涉及一种水蛭肽和制备方法

背景技术

世界卫生组织统计年鉴指出，心血管疾病﹑恶性肿瘤﹑呼吸器官疾病﹑车祸和自杀依次分别是目前世界上的五大死因。我国心血管疾病年死亡人数达百万人，随着人们生活水平的提高，心血管疾病将日趋严重。

冠心病是心血管疾病的重要类型，其发病机制与动静脉血栓形成及血栓栓塞有关，主要是由于血脂代谢异常，引起血管内膜的炎性免疫反应和血小板聚集，在动脉内一些类似粥样的脂类物质堆积而成白色斑块，血管狭窄到一定程度，血栓形成，称为动脉粥样硬化病变。这些斑块渐渐增多造成动脉腔狭窄，使冠心病是世界上最常见的、致死率最高的慢性疾病之一。

随着我国社会经济的快速发展、生活方式的改变以及人口老龄化,冠心病的发病率呈逐年增长的趋势。世界卫生组织预测我国每年有超过100万人死于冠心病。冠心病将严重威胁人民生命和健康,并为社会和家庭带来沉重的经济负担。为此,加强开展以冠心病为代表的心血管疾病的药物开发，具有较高的社会价值。

目前，多肽类药物水蛭素是较为常用的天然的凝血酶特异性抑制剂，分为水蛭素（Hirudin,H)及重组水蛭素(recombine Hirudin,rH)，其含有65-66个氨基酸，具有良好的抗凝、抗动静脉血栓作用以及毒副作用低等特点，已经引起国内外各大厂商的高度重视。但是肽类药物临床应用的副作用，主要是免疫原性。也就是说，肽类药物的分子量愈大其免疫原性越大。分子量越小其免疫原性越小，由于水蛭素及重组水蛭素其分子量较大，具有半抗原性，影响其在临床的使用。因此，临床使用中需要抗原反应低，抗血栓作用明显的多肽类药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种水蛭肽和制备方法，该水蛭肽为一组抗凝血酶活性物质，其为重组水蛭素(recombine Hirudin,rH)在大鼠尿中的代谢产物，即为rH1-51或rH1-52或两者的混合物，本发明不仅保留了重组水蛭素的抗凝血酶的活性，而且由于分子量（5000D左右）较重组水蛭素（7000D）小，免疫原性明显降低，减少不良反应的发生。

本发明的水蛭肽rH1-51序列见序列表SEQ ID No.1；

本发明的水蛭肽rH1-52序列见序列表SEQ ID No.2；

本发明的水蛭肽为水蛭肽rH1-51和水蛭肽rH1-52两者的混合物。

重组水蛭素(rH)的原型结构如下：

本发明的制备方法如下：

（1）大鼠尾静脉注射重组水蛭素，注射剂量为6mg/kg，收集给药后0.5-4h的尿液，以供分离提取代谢产物；

（2）用凝胶色谱法对空白和样品尿液进行初步分离，色谱条件：凝胶柱流动相：0.02mol/l的PBS溶液，pH7.0，流速0.5-1.0ml/分钟，检测波长为215nm。收集流出液，每分钟收集1管。取收集液，-70℃冷冻，冷冻干燥保存；

（3）将凝胶色谱收集到的收集液进行再用C8反相色谱法纯化，色谱条件为：八烷基硅烷键合硅胶柱，进样量20μl，梯度洗脱，乙腈：0.1%TFA25min内从15：85变至45：55，流速0.5ml/min，检测波长为215nm。反复进样，收集2个水蛭肽rH^1-51和rH^1-52及其混合物，-70℃冷冻，冷冻干燥保存；

（4）水蛭肽rH^1-51的的序列见序列表SEQ ID No.1，rH^1-52的序列见序列表SEQ ID No.2；

本发明中的重组水蛭素为N端结构为[Ile¹,Thr²]-63-脱硫酸基的重组水蛭素，由大连高新生物制药有限公司提供。

在对N端结构为[Ile1,Thr2]-63-脱硫酸基的重组水蛭素进行大鼠体内代谢研究发现，其代谢产物仍然具有水蛭素样的抗凝血酶活性，我们对其进行提取分离和结构分析，确认其为一组从重组水蛭素C端去掉14-15个氨基酸的小肽，具有抗凝酶活性，小肽的分子量为5160D，氨基酸序列为重组水蛭素氨基酸1-51处及1-52处。

本发明的主要特点是通过降低水蛭素的分子量，进而降低水蛭素的免疫原性，并保持水蛭素的抗凝血酶活性不变。本发明的水蛭肽分子量（5000D左右）较水蛭素（7000D）小，因而免疫原性将显著的降低，有望成为新一代抗血栓新药，具有良好的发展前景和临床应用价值。显示出作为制备的药物的应用前景。