[发明专利]兔出血症病毒RT-PCR检测方法

说明书

本申请是申请日为2011年3月15日，申请号为：201110062529.2，发明名称为“兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法”的专利申请之分案申请。

技术领域

本发明涉及一种兔出血症病毒的分子检测方法，具体地说，涉及一种兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其属于生物技术领域。

背景技术

兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种高度接触烈性传染病，传播快，发病急，发病率和致死率都很高，以呼吸系统出血、肝坏死、实质脏器水肿、淤血及出血性变化为特征，是兔的一种毁灭性传染病，目前所有已测的兔的品种都表现出易感性。自然条件下，RHDV主要侵害成年兔，2月龄以下的仔兔自然感染时一般不发病。该病对养兔业造成巨大的经济损失，也严重威胁濒临灭绝的野兔品种。由此，RHDV引起了国内外学者高度重视，从形态学、生物化学和分子生物学等各个方面系统的研究该病毒。

RHDV在国际病毒分类委员会（ICTV）2000年最新的第七次报告中被列入新成立的杯状病毒科（Caliciviridae）兔病毒属（Lagovirus）。RHDV为单股正链RNA病毒，其基因组由7437个核苷酸组成，分子量为2.4×10⁶-2.6×10⁶，5’端没有帽状结构，而是共价结合与感染相关的Vpg（virion protein,genome linked）蛋白，3’末端具有一个短的PolyA尾。第1-9nt为5’非编码区，最后59nt为3’非编码区，含有两个开放阅读框架(ORF)，第10-7044nt为ORFl编码的一个含有2344个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白经蛋白水解酶加工成主要衣壳蛋白VP60以及包括RNA聚合酶和蛋白酶在内的三个非结构蛋白。根据分析，该病毒的RNA基因组结构与同科的猫嵌杯样病毒不一样，仅含有两个开放阅读框。

RHDV的免疫原性蛋白、衣壳蛋白VP60，在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原。VP60基因全长1740bp，在病毒诱导机体的免疫反应中起主要作用，其核苷酸极端保守。RHDV是一种急性、高度致死性RNA病毒，在兔体内停留时间短，没有足够的时间让病毒发生有利于进化的变异，因此几十年中RHDV仍然能保持高序列同源性。

目前，已有将分子生物学应用到RHDV诊断中的研究，其主要包括玻片凝集试验（SHA）检测RHDV、酶联免疫吸附法（ELISA）检测RHDV、RT-PCR检测RHDV等，但上述这些方法存在敏感性低、可重复性差、结果判定易受多种因素影响、处理耗时多等问题。

荧光定量PCR（fluorescence quantitative polymerase chain reaction），又称实时定量（real-time quantitative）PCR。这种技术是在PCR技术基础上发展起来的高度灵敏的核酸定量技术。它是一种在PCR体系中引入了荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使PCR扩增和终产物检测全处在封闭的条件下进行，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析方法，具有实时监测、无污染、快速、灵敏、精确、特异等特点，极大的克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题，其最主要的优势是能对待测样本起始PCR反应模板进行准确定量，扩大了PCR的应用范围，使得PCR技术更广泛的应用于临床，在监测患者病情、预后、指导用药等方面。目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。