[发明专利]兔出血症病毒RT-PCR检测方法

权利要求书

1.用于兔出血症病毒RT-PCR检测的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.4和5所示。

2.含有权利要求1所述引物的检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，PCR反应体系为：

每25μL反应液中含有：10×RT-PCR缓冲液2.5μL、超纯dNTP混合物1μL，各10mM、5×RT-PCR增强剂5μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.25μL、2.5U/μL Hotmaster DNA聚合酶1.25μL、Quant反转录酶0.25μL、10mmol/L的上下游引物各0.5μL、RNA模板1μL、RNase-free ddH₂O补至25μL。

4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，PCR反应条件为：50℃、30min；94℃、2min，94℃、1min，51.7℃、1min，65℃、1min，扩增35个循环；65℃、10min。

5.权利要求1所述引物在制备用于检测兔出血症病毒阳性标准品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取RHDV病毒RNA，用核苷酸序列如SEQ ID No.4和5所示的引物，进行一步法RT-PCR扩增，得到目的片段；然后将该目的片段克隆到pGEM-T Easy载体上，转入感受态细胞大肠杆菌DH5α，提取白斑阳性质粒；

2）对提取的质粒进行Sac Ⅰ酶切，使质粒DNA线性化，然后在T7RNA聚合酶作用下体外转录RNA，得到阳性标准品。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）酶切的反应体系为：RE10×缓冲液2μL、乙酰化的BSA0.2μL、质粒DNA2.3μL、10U/μL Sac Ⅰ0.5μL、ddH₂O补加至20μL。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）酶切的反应条件为：37℃温度下孵育1h。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，体外转录RNA的反应体系为：5倍优化转录缓冲液4μL；DTT2μL、重组核糖核酸酶抑制剂0.5μL；rATP、rGTP、rUTP和rCTP混合物4μL；线性化DNA8μL；19U/μL T7RNA聚合酶1μL；DEPC水补加至20μL。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，体外转录RNA的反应条件为：37℃温度下孵育1h，然后加入RQ1 0.5μL，37℃温度下孵育15min。