[发明专利]一种乙基香兰素抗原和抗体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫分析测试领域，涉及一种乙基香兰素抗原和抗体的制备方法及其应用。

背景技术

香兰素，3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，又称香草醛；甲基香兰素（Vanillin）3,4-二甲氧基苯甲醛，又称藜芦醛、绿藜芦醛、香草醛甲醚；乙基香兰素（EthylVanillin），3-乙氧基-4-羟基苯甲醛，又称乙基香草醛、乙基凡尼林，三者均为白色或微黄色结晶性粉末，微溶于水，溶于乙醇、甘油、乙醚、氯仿及香料中；皆具有香荚兰香气及浓郁的奶香，是重要的食品添加剂，广泛用作食品、饮料以及日化用品等领域。但是，大剂量使用香兰素等香料将有害健康。目前，给婴儿添加配方奶粉成为世界各地普遍采用的做法，而婴幼儿是对有害物质最敏感的群体。近年来由于婴幼儿食品特别是配方奶粉的质量优劣或真假问题而引发的重大食品安全事件屡见不鲜。

目前关于乙基香兰素的测定方法主要有分光光度法、电化学法、高效液相色谱法、气相色谱和气质联用法。这些分析方法具有高灵敏度和特异性的特点，但操作繁琐，需要精密仪器和受过专业培训的操作人员，且耗时长。而特异性的结合反应，例如抗原-抗体反应，已经广泛用于检测生物样品中存在的各种物质的免疫测试中。其中，胶体金免疫层析技术发展迅速，已被人们所熟知，与仪器分析法比较，胶体金层析技术具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作等优点。

在胶体金免疫层析分析试纸的制备上，最为重要的环节是被测物的免疫源性物质，即被测物的免疫抗原和免疫抗体的制备，而制备高特异性的抗体首先是要有纯度较高，结构合理的免疫原。因此，研究和筛选特异性更强、灵敏度更高的乙基香兰素免疫分析抗原抗体和对于提高和完善本领域检测手段具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种乙基香兰素半抗原及其制备方法。

本发明的目的之二提供一种乙基香兰素完全抗原及其制备方法，乙基香兰素完全抗原是在乙基香兰素半抗原的基础上进一步制备得到。

本发明的目的之三提供一种乙基香兰素抗体及其制备方法。

本发明的目的之四在于提供一种乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸及其制备方法。

本发明的目的还在于利用上述乙基香兰素半抗原、乙基香兰素完全抗原及乙基香兰素抗体在应用胶体金免疫层析分析技术检测乙基香兰素中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种乙基香兰素半抗原，具有如式（Ⅰ）所示的结构：

其中，R为碳链长度为C₁～C₆的亚烷基；X是羧基、巯基或氨基。

上述乙基香兰素半抗原的制备方法，包括如下步骤：

（1）将乙基香兰素和4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯溶解于强极性有机溶剂中，加入碳酸钾和四丁基碘化铵，15～25℃反应12～16h；反应结束后加入冰水溶解反应液，用乙酸乙酯萃取，水洗涤后收集有机相，干燥得到粗品。

（2）将步骤（1）所得粗品溶于无水乙醇中，加入氢氧化锂15～25℃反应2～4h，加水稀释，乙醚萃取，取下层，再加入酸调pH至4～6.0，有固体析出，经氯仿洗涤、抽滤、蒸干得到乙基香兰素半抗原。

步骤（1）中所述的强极性有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺或乙腈。

步骤（1）中所述的乙基香兰素、4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯、碳酸钾的摩尔比优选为1:1～2:3～5；

步骤（1）中所述的四丁基碘化铵的投料量优选为乙基香兰素质量的10～20%。

步骤（1）中所述的干燥优选为通过30～40℃旋转蒸干20分钟干燥。

步骤（2）中所述的氢氧化锂的用量优选为乙基香兰素质量的20～40%。

一种乙基香兰素完全抗原，具有如式（Ⅱ）所示的结构：

其中，R为碳链长度为C₁～C₆的亚烷基；P为载体物质；载体物质为蛋白质、利用具有足够数目氨基酸的合成聚氨基酸或其它具有反应官能团的合成或天然多聚体物质；优选的载体物质为牛血清蛋白（BSA）、鸡蛋白蛋白（OVA）或钥孔戚血蓝蛋白（KLH）。