[发明专利]一种双酚A单链抗体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种双酚A单链抗体的筛选方法，属于生物技术领域，用于制备特异识别双酚A的高效抗体与研制可以快速检测双酚A残留的免疫速测试剂盒及治疗相关疾病的用途中。

背景技术

双酚A(Bisphenol A，缩写为BPA)双酚A学名2，2-二(4-羟基苯基)丙烷，简称二酚基丙烷。在1891年，俄罗斯化学家A.P.Dianin首次合成双酚A，合成这种化合物时，是采用丙酮与两当量的苯酚在酸性介质中缩合而成。双酚A的应用十分广泛：不仅可以应用于化工领域生产，如：生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等多种高分子材料和增塑剂、阻燃剂、抗氧剂、热稳定剂、橡胶防老剂、农药、涂料等精细化工产品；也可以用于日常生活用品的生产，例如：罐头食品和饮料的包装、奶瓶、水瓶、牙齿填充物所用的密封胶、眼镜片、收银小票和输水管道的内涂层等。19世纪30年代中期，人们发现双酚A可以发挥雌激素作用。有科学家认为，长时间吸进双酚A粉末有害于肝功能及肾功能；特别严重的是它会降低血液中血红素的含量。而动物研究表明，双酚A可能导致很多疾病，包括生殖系统发育异常、女性提早性成熟、精子数量减少以及前列腺癌和乳腺癌等与激素相关的癌症、双酚A进入人体子宫内，可能导致后代的疾病变异，包括肥胖症、癌症和糖尿病。

针对上述情况，发展检测双酚A残留的简便、快速、灵敏的方法是有效遏制滥用双酚A的重要技术手段和维护法规制度的必要保障。免疫学分析方法检测BPA具有快速简便的特点，而免疫分析方法检测需要有BPA的特异性抗体。但是BPA是小分子半抗原，免疫原性不强，通过传统的免疫动物的方法制备抗体较困难，制备的周期也较长。

基因工程抗体单链抗体(Singe chain variable fragment，scFv)具有低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强、成本低、可大规模生产等特点。目前，主要应用核糖体展示技术和噬菌体展示技术来筛选和制备单链抗体。核糖体展示技术是一种完全不依赖于细胞的体外展示技术，是在体外筛选和显示功能蛋白的方法，不需经过转化，文库库容量远大于噬菌体单链抗体文库。此外核糖体展示技术还具有建库和筛选方法简便，便于引入突变和重组技术如寡核苷酸定点突变，倾向错误PCR，DNA shuffling等，提高了靶标蛋白的亲和力；基因突变与表型筛选都在体外进行，简化了操作步骤。天然抗体库的抗体基因来源于未经免疫的动物或人体的B细胞，从理论上讲，能够代表所有初级B细胞含有的抗体基因的多样性，使用任何抗原都可能从中筛选到相应的抗体，具有较强的通用性。利用核糖体展示技术筛选针对小分子半抗原抗体的研究较少，尤其是从天然抗体文库中筛选更为少见。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种潜在的检测和医学用抗双酚A单链抗体。

本发明的第二个目的提供一种抗双酚A单链抗体的制备方法。

本发明的第三个目的提供抗双酚A单链抗体在制备检测试剂盒中的用途。

本发明的技术方案概述如下：

本发明提供的抗双酚A单链抗体是从核糖体展示鼠源天然单链抗体库中筛选获得的并进行了功能性表达。

本发明提供的抗双酚A单链抗体的制备方法为：

1核糖体鼠源天然单链抗体文库scFv的扩增

全文库由本实验室孙亚楠构建。所构建的抗体文库是从未免疫的6-8周龄的小鼠中获得总mRNA，然后经反转和扩增后获得VH和VL。(G4S)3linker通过SOE法连接VH和VL，构建成单链抗体文库，大小约为750bp。经过测序及序列比对，所构建的文库多样性好，可用于单链抗体的筛选。

扩增出大小为102bp核糖体展示元件T(包括T7启动子，5’茎环，核糖体结合位点)和大小为298bp间隔序列P(噬菌体P蛋白部分序列)，含3’茎环，作为间隔序列，分别经序列测定，与理论序列完全一致。以重叠引物延伸法(splicing by overlap extension，SOE)将T片段与scfv文库连接，再将P片段与其拼接，构建成核糖体展示单链抗体文库，大小为1200bp左右。

其中核糖体展示元件中的启动子根据体外翻译系统的不同可以为原核启动子(T7启动、tac启动子等)，本发明优选原核启动子特别是T7启动子。

2抗双酚A单链抗体的筛选