[发明专利]一种双酚A单链抗体及其用途

权利要求书

1.一种抗双酚A单链抗体，其特征在于可以特异识别小分子物质双酚A。 

2.权利要求1抗双酚A单链抗体制备方法，由如下步骤组成： 

(1)抗双酚A单链抗体的筛选 

将扩增得到的全文库经转录和翻译后，用于BPA-OVA或BPA-BSA作为半抗原固相交替筛选特异于BPA的单链抗体，每轮筛选的过程中都采用了复筛选法。筛选完成以后，调节Mg2+浓度将筛选得到的单链抗体-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。得到的DNA文库与核糖体展示元件T启动子和P蛋白连接，构成筛选的全文库，再经体外转录、体外翻译、亲和筛、RT-PCR扩增过程，反复筛选几轮后的到单链抗体的文库。经过五轮筛选后，得到的mRNA经紫外分光光度法测定，结果显示吸光度明显增加，且RT-PCR扩增得到的DNA条带亮度明显增加，说明筛选后的抗体文库中抗原阳性的抗体得到了富集。 

Mg2+浓度根据筛选条件的严谨性不同进行调整。 

(2)抗双酚A单链抗体的功能性表达 

筛选得到的单链抗体进行序列鉴定，挑选出无致死突变的克隆子，将单链抗体基因与pTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，在27.8KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，破碎后确定表达产物主要以包涵体的形式存在于沉淀中，需要对包涵体进行变复性获得有生物活性的单链抗体。 

抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，优选pTIG-TRX。 

标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6×组氨酸标签等，优选6×组氨酸标签。 

(3)抗双酚A单链抗体的鉴定 

将阳性克隆子表达后的包涵体复性后使用间接ELISA和竞争间接ELISA法进行鉴定，结果筛选出两株克隆子对双酚A具有竞争结合活性，对其进行序列比对，结果表明CDR区有相似性。 

3.权利要求2中所述核糖体展示元件中的启动子根据体外翻译系统的不同可以为原核启动子(T7启动、tac启动子等)，优选原核启动子特别是T7启动子。 

4.权利要求2中所述筛选方法可以采用BPA-BSA、BPA-OVA进行固相筛选，并且在筛选的过程中采用了复筛选法，优选在不同筛选轮次中采用不同包被原交叉筛选。 

5.权利要求2中所述抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，并根据载体不同选择不同表达宿主，优选pTIG-TRX载体。 

6.权利要求2中所述标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6×组氨酸标签等，优选6×组氨酸标签。