[发明专利]一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂

说明书

技术领域

本发明属于鸭乙型肝炎病毒检测技术领域，涉及一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂。

背景技术

1980年Mason等从家养的北京鸭体内发现鸭乙型肝炎病毒（Duck Hepatitis B Virus，DHBV），DHBV属于禽嗜肝DNA病毒，其嗜肝性、毒粒形态、结构和基因复制等方面与HBV很相似，目前，感染DHBV的北京麻鸭已成为HBV复制、感染机制研究与治疗策略评估的重要实验动物模型]。DHBV DNA的定量检测成为应用此模型的一个重要指标，以往多采用Southern blot杂交、斑点杂交等方法对DHBV DNA进行定量，由于这些方法灵敏度较低、稳定性差、操作复杂，已被定量PCR方法取代。但是，由于缺乏标准的实验动物和统一、通用的DHBV DNA定量检测方法，各地研究者往往选择本地麻鸭感染的DHBV，针对DHBV基因的不同区域建立检测方法。由于不同地区、不同鸭种感染的DHBV基因存在差异，造成了研究者实验结果缺乏可比性，借鉴已有方法也存在不确定性。

既往研究针对DHBV的P基因或S基因设计引物，建立DHBV PCR检测方法，缺乏通用性，因为DHBV有不同的亚型，编码外膜蛋白和聚合酶蛋白的S基因和P基因容易变异。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂，该方法适于不同地区、不同鸭种的定量检测，具有灵敏度高、特异性强的特点。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，包括以下操作：

1）以包含DHBV Core基因片段的质粒载体作为标准品，以鸭血清中提取到的DNA为待检品；分别以标准品和待检品为模板，在包含上游扩增引物、下游扩增引物和连接有荧光标记物的检测探针的扩增体系中进行扩增；

所述的上游引物为：ggactcgaac ctagaaga；

所述的下游扩增引物为：ttatttccta ggcgaggg；

所述的检测探针为：accacagttg tctatgggag aag；

2）在扩增结束后，分别采集标准品和待检品的扩增产物荧光标记物的荧光信号；

3）根据标准品的扩增产物的荧光信号与质粒载体的对应关系建立标准曲线，然后根据待检品的荧光信号在标准曲线上的位置，确定待检品中鸭乙型肝炎病毒的含量。

所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基因序列克隆到pGEM-T载体中。

所述的DHBV Core区基因序列的获得为：

以pBR322/2DHBV质粒为模板，以上游引物F1和下游引物R1进行PCR扩增，所述的上游引物F1为：gggatccata tcaatgcttc tag；

下游引物R1为：gctcgagtta tttcctaggc gag。

所述的待检品的获取为：

血清中加入其体积1～2倍的DNA提取液，充分混匀，100℃煮沸5～15min，4℃放置过夜，离心取上清液，得到待检品；

所述的DNA提取液包括0.1～0.5mol/L的NaOH、2～2.5mol/L的NaCl、以及质量浓度为0.5～1.0%的SDS。

所述的扩增体系包括0.05～0.1U的聚合酶、250～500μM的dNTP，10～20mM Tris-HCl，50～100mM KCl、1.5～3mM MgCl₂，上游引物25～100mM，下游扩增引物25～100mM，检测探针5～20mM，作为模板的标准品或待检品的体积分数为10～20%。

所述的扩增体系为25μl，包括：

2×HotStart Taq PCR MasterMix12.5μl，包括：0.1UHotStart Taq Polymerase/μl，500μM dNTP each，20mM Tris-HCl、pH8.3，100mM KCl和3mM MgCl₂；

上游引物0.5μl、50mM；

下游扩增引物0.5μl、50mM；

检测探针0.5μl、10mM；

DEPC-H₂O9μl；

标准品或待检品2μl。

所述的荧光标记物为FAM，其对应的检测波长为490nm。