[发明专利]一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂

权利要求书

1.一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下操作：

1）以包含DHBV Core基因片段的质粒载体作为标准品，以鸭血清中提取到的DNA为待检品；分别以标准品和待检品为模板，在包含上游扩增引物、下游扩增引物和连接有荧光标记物的检测探针的扩增体系中进行扩增；

所述的上游引物为：ggactcgaac ctagaaga；

所述的下游扩增引物为：ttatttccta ggcgaggg；

所述的检测探针为：accacagttg tctatgggag aag；

2）在扩增结束后，分别采集标准品和待检品的扩增产物荧光标记物的荧光信号；

3）根据标准品的扩增产物的荧光信号与质粒载体的对应关系建立标准曲线，然后根据待检品的荧光信号在标准曲线上的位置，确定待检品中鸭乙型肝炎病毒的含量。

2.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基因序列克隆到pGEM-T载体中。

3.如权利要求2所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的DHBV Core区基因序列的获得为：

以pBR322/2DHBV质粒为模板，以上游引物F1和下游引物R1进行PCR扩增，所述的上游引物F1为：gggatccata tcaatgcttc tag；

下游引物R1为：gctcgagtta tttcctaggc gag。

4.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的待检品的获取为：

血清中加入其体积1～2倍的DNA提取液，充分混匀，100℃煮沸5～15min，4℃放置过夜，离心取上清液，得到待检品；

所述的DNA提取液包括0.1～0.5mol/L的NaOH、2～2.5mol/L的NaCl、以及质量浓度为0.5～1.0%的SDS。

5.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的扩增体系包括0.05～0.1U的聚合酶、250～500μM的dNTP，10～20mM Tris-HCl，50～100mM KCl、1.5～3mM MgCl₂，上游引物25～100mM，下游扩增引物25～100mM，检测探针5～20mM，作为模板的标准品或待检品的体积分数为10～20%。

6.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的扩增体系为25μl，包括：

2×HotStart Taq PCR MasterMix12.5μl，包括：0.1UHotStart Taq Polymerase/μl，500μM dNTP each，20mM Tris-HCl、pH8.3，100mM KCl和3mM MgCl₂；

上游引物0.5μl、50mM；

下游扩增引物0.5μl、50mM；

检测探针0.5μl、10mM；

DEPC-H₂O9μl；

标准品或待检品2μl。

7.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的荧光标记物为FAM，其对应的检测波长为490nm。

8.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的扩增程序为：94℃预变性2min；94℃15s，49℃30s，72℃30s；40个循环。

9.一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，包括标准品和PCR扩增体系；

所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基因序列克隆到pGEM-T载体中；

所述的PCR扩增体系包括0.05～0.1U的聚合酶、250～500μM的dNTP，10～20mM Tris-HCl，50～100mM KCl、1.5～3mM MgCl₂，上游引物25～50mM，下游扩增引物25～50mM，检测探针5～10mM，作为模板的标准品或待检品的体积分数为10～20%。

10.如权利要求9所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述的pGEM-T/DHBV Core重组质粒中的DHBV Core区基因是以以上游引物F1和下游引物R1对DHBV Core区基因进行PCR扩增，所述的上游引物F1为：gggatccata tcaatgcttc tag；

下游引物R1为：gctcgagtta tttcctaggc gag；

所述的扩增体系为25μl，包括：

2×HotStart Taq PCR MasterMix12.5μl，包括：0.1UHotStart Taq Polymerase/μl，500μM dNTP each，20mM Tris-HCl、pH8.3，100mM KCl和3mM MgCl₂；

上游引物0.5μl、50mM；

下游扩增引物0.5μl、50mM；

检测探针0.5μl、10mM；

DEPC-H₂O9μl；

模板2μl。