[发明专利]一种制备malforminC的方法

说明书

技术领域：

发明涉及药品技术领域，即利用生物发酵生产malformin C的方法，即提供了微生物发酵制备malformin C的一个菌株和用其发酵液生产malformin C的方法。

技术背景：

环肽类化合物malformin C是1968年由Steenbergen S等人从发霉的大米上找到的一株黑曲霉产生，其发酵产率极低，只有200ug/ml(Steenbergen，S.，and E.D.Weinberg.Trace metal requirements for malformin biosynthesis.Growth.1968，32：125-134)。此外，Yasuhiro Kojimal等采固相合成的方法合成malformin C，收率只有15％(Yasuhiro Kojimal，Toshiaki Sunazukal，Kenichiro Nagail，et al.Solid-phase synthesis and biological activity of malformin C and its derivatives.The Journal of Antibiotics2009，62：681-686)。Keiichi HAGIMORI等人在2007年阐述了malformin C的抗癌机制。即malformin C作为一个G2期检验点(checkpoint)的抑制剂来达到抗癌的效果(Keiichi HAGIMORI，Takashi FUKUDA，Yoko HASEGAWA，et al.Fungal Malformins Inhibit Bleomycin-Induced G2 Checkpoint in Jurkat Cells.Biol.Pharm.Bull.2007，30(8)：1379-1383)。因此，找到一个收率高、成本低的新方法来积累malformin C对于开发这类抗肿瘤药物具有非常重要的作用。

发明内容：

本发明提供了一套完整的从生产到分离纯化malformin C的方法。选择菌株SYP2612，采用需氧微生物发酵法，从其发酵液中分离纯化获得malformin C。

该方法包括原始菌种的活化、摇瓶种子培养、微生物发酵、以及后提取的各种步骤。其生产工艺包括：

脱脂牛奶冻干管菌种→斜面活化→摇瓶种子→微生物发酵→终止发酵，提取纯化获得malformin C。

本发明所述的摇瓶种子培养是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，挖取适量菌体斜面，转移到种子摇瓶中，在自动旋转摇瓶机上震荡培养，50-300rpm，25～30℃，培养24-48小时获得摇瓶种子。本发明涉及的菌株SYP2612已提交相关单位保藏， 其分类命名及保藏信息如下：

分类命名：塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心

保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2012年12月14日

保藏编号：CGMCC NO.6992

本发明所述的微生物发酵是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，按照一定比例(1-15％)转入种子液。既可以采用在自动旋转摇瓶机上震荡，100-300rpm，25～30℃培养96～144小时后，停止发酵；也可以使用发酵罐进行微生物有氧发酵，100-400rpm，25～30℃培养96～144小时后，停止发酵。均可获得发酵产物malformin C。

本发明所述的微生物发酵的提取、分离、纯化过程如下：将所述的微生物发酵液用高速离心机或者布氏漏斗减压抽滤，除去菌丝体，将发酵上清液用乙酸乙酯或水饱和正丁醇等体积分别连续萃取三次，合并乙酸乙酯或水饱和正丁醇萃取液上层部分，用旋转蒸发仪减压浓缩至干燥，用甲醇完全溶解后取出，经过硅胶柱层析、经TLC获得目标馏分后，进一步采用HPLC法制备malformin C。

附图说明

附图1：菌株SYP2612菌落形态

附图2：菌株SYP2612孢子囊和孢子形态

附图3：菌株SYP2612依据ITS-5.8S rDNA序列的系统进化树

附图4：菌株SYP2612代谢产物的分离纯化流程

附图5：malfominC的ESI-MS图谱