[发明专利]循环肿瘤细胞（CTCs）荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及检测样品中循环肿瘤细胞（CTCs）的应用。另外，本发明还涉及可以在上述应用中所用的试剂和试剂盒等。

背景技术

据统计，约90％的癌症患者死于继发性肿瘤，而原发性肿瘤转移或释放循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）通常是导致继发性肿瘤形成的原因。早在1869年，科学家Ashworth首次提出CTCs的概念。目前CTCs定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。进入循环未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶。因此，在外周血中检测到CTCs预示着有可能发生肿瘤转移，检测外周血中的CTCs具有重要的临床应用价值，对于临床早期筛查和诊断、疗效及预后意义重大。美国食品与药品监督管理局(FDA)也已批准用于预测转移性乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌的无进展生存时间(progression-free survival，PFS)和总存活时间(overall survival，OS)的CTCs检测系统。

对于数以亿万计的外周血细胞而言，CTCs在外周血中的数量稀少，大约每10⁵～10⁷个单核细胞中才有一个CTCs。现有针对CTCs的检测技术主要有免疫细胞化学法(immunocytochemistry，ICC)、流式细胞术（flow cytometry，FCM）和逆转录聚合酶链反应(reversetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)。免疫细胞化学法缺点是敏感性低，分化差的肿瘤细胞不表达目标抗原、淋巴细胞交叉反应等因素都将影响检测特异性；流式细胞术价格昂贵，耗时较长，敏感度低；而RT-PCR方法步骤繁琐，费时较长，容易污染，给临床检测带来巨大不便，且由于取样时上皮细胞污染、标志物非法转录、个体间表达差异等也可能造成假阳性及假阴性。

尽管也有利用荧光PCR进行检测CTCs的先例（如参见：金翔凤,等.非小细胞肺癌病人外周血CK19mRNA表达及意义.齐鲁医学杂志,第23卷第3期），但是仍旧受到假阳性及假阴性（尤其是假阴性）结果的困扰，而且判读结果不直观，难以进行半定量分析，由此灵敏度度很低，不得不以“以浓度≥每微升1拷贝数为阳性结果，浓度<每微升1拷贝数为阴性”（即1000copy/ml）来划分判断，这对于许多实际患者中每毫升样品只有1～100copy的情况而言，几乎没有推广使用的价值，造成大量假阴性结果，使得医生都无所适从。

为此，本发明人经过艰苦而长期的努力，发现使用常规的RNA提取试剂盒对最终检测结果效果不佳，因此从处理样品（如外周血）起就需要改进；还发现改进部分引物和探针及其PCR扩增步骤能够使得判读结果直观，可以在更大范围内进行半定量分析；更令人意外的是，本发明人抛弃了目前一味追求定量或半定量分析的研究误区，设计了互不干扰的引物对和探针，在保留一定半定量分析的能力的同时，大大增加了定性分析的灵敏度和可靠性。而且，本发明的方法易于自动化和规模化，能够减小人为操作误差和污染，节省操作时间和成本，可广泛用于对乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌患者病情分级、预后评估，为治疗方案的选择和治疗效果的监测提供依据。

发明内容

本发明目的旨在于提供新的检测方法中所用的试剂在制备用于检测循环肿瘤细胞分子特异性标志物的试剂盒中的应用。另外，本发明还提供了可以在上述应用中使用的试剂以及试剂盒等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了检测方法中所用的试剂在制备用于检测循环肿瘤（如，乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌和/或胃癌，优选是乳腺癌）细胞分子特异性标志物的试剂盒中的应用，其中所述检测方法包括：

（1）对样品（如，外周血）进行处理；

（2）对步骤（1）获得的处理产物进行核酸提取；和，

（3）对步骤（2）获得的核酸提取物进行荧光PCR检测。

尽管可以通过其他方法来检测循环肿瘤细胞分子特异性标志物，但是优选在本发明第一方面的应用中，检测循环肿瘤细胞分子特异性标志物也是通过所述检测方法实施的。