[发明专利]循环肿瘤细胞（CTCs）荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.检测方法中所用的试剂在制备用于检测循环肿瘤（如，乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌和/或胃癌，优选是乳腺癌）细胞分子特异性标志物的试剂盒中的应用，其中所述检测方法包括：

（1）对样品（如，外周血）进行处理；

（2）对步骤（1）获得的处理产物进行核酸提取；和，

（3）对步骤（2）获得的核酸提取物进行荧光PCR检测。

2.权利要求1所述的应用，其中步骤（3）中的荧光PCR检测的方法包括：

（3-1）在单个PCR反应管中混合核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且两种探针标记的荧光基团检测波长不同，其中，

靶核酸引物对包括：

AACGAGCCAGCCTATCTTGAATC

TTCTGACTTGATCTGTGACCGGAG

CTGAATCCAATCTTTGCTCACC，和

ATGCTTGAAGGCCAATATGA

靶核酸探针包括：

CCGACATCGCCGCTCCGTAACAT，和

CCTCTATTCAGATCCAGCGGATA；

（3-2）进行反转录和PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，

（3-3）根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有标志物靶核酸存在于样品中。

3.权利要求2所述的应用，其中，

各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团选自FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5；

PCR反应的每个循环的条件为94℃10s和60℃30s；和/或，

每种靶核酸探针在单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml，优选为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。

4.权利要求1所述的应用，其中步骤（2）中的核酸提取的方法是磁珠法提取RNA的方法。

5.权利要求4所述的应用，其中核酸提取的方法包括，

向处理产物加入核酸萃取液（优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液（如，Tris-HCl），保温后加入磁珠（如，磁珠），混合均匀后，磁分离，弃上清，然后洗涤（优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱（优选洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液（如，Tris-HCl）。

6.权利要求1所述的应用，其中步骤（1）中的处理的方法包括，

去除外周血的血浆后用细胞裂解液（如，氯化铵红细胞裂解液）裂解，加入抗CD45免疫磁珠，混合均匀后保温，磁分离，弃上清，然后洗涤（优选用pH缓冲液（如，PBS）洗涤）。

7.权利要求1～6之任一所述的应用中的试剂，其为所述应用中步骤（3）所用的试剂，其特征在于，其包括靶核酸引物对和探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且两种探针标记的荧光基团检测波长不同，其中，

靶核酸引物对包括：

AACGAGCCAGCCTATCTTGAATC

TTCTGACTTGATCTGT GACCGGAG

CTGAATCCAATCTTTGCTCACC，和

ATGCTTGAAGGCCAATATGA

靶核酸探针包括：

CCGACATCGCCGCTCCGTAACAT，和

CCTCTATTCAGATCCAGCGGATA。

8.权利要求7所述的试剂，其还包括反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶和dNTP。

9.权利要求7所述的试剂，其中各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团选自FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5。