[发明专利]生物法制备高纯度L-叔亮氨酸

说明书

技术领域

本发明涉及生物合成法制备L-叔亮氨酸的方法。

背景技术

L-叔亮氨酸是制备是生产阿扎那韦(抗HIV药物)、波普瑞韦(Boceprevir)(抗丙肝病毒药物)、特拉匹韦(Telaprevir)(抗丙肝病毒药物)等抗病毒药物中间体，同时由于叔丁基的空间位阻大，叔亮氨酸又作为金属的手性配体应用于不对称合成。

目前L-叔亮氨酸的制备方法主要有化学合成法和生物合成法。其中化学合成法又主要有化学合成、化学拆分和手性合成三种方法。1993年，U.Groth等以2，5-二乙基吡嗪为原料(Liebigs Ann.Chem.1993，715-719)，经叔丁基化、水解合成叔亮氨酸乙酯，收率70％。由于所用试剂三乙基氧鎓四氟硼酸盐、N-氯代琥珀酰亚胺和叔丁基锂价格昂贵，因此成本高；另外，工业化规模制备易产生有害氧化物。1994年，Clive等以特戊醛为原料(Tetrahedron Lett.1994，35：2459～2462)，首先利用Wittig反应，经过加成，取代，水解，氢化，得到消旋的叔亮氨酸，总收率仅为25％。中国专利CN200710044378报道了消旋叔亮酰胺与光学纯酸性拆分剂(如扁桃酸、对甲基二苯甲酰酒石酸等)在拆分溶剂中反应成盐析出，再经酸水解得L-叔亮氨酸。美国专利US201224537(2012年)报道了利用D-(+)-二苯甲酰酒石酸与L-叔亮氨酸具有选择性沉淀反应生成D-(+)-二苯甲酰酒石酸-L-叔亮氨酸沉淀，经过滤、水解该沉淀物即可得到L-叔亮氨酸。选择性拆分D，L-叔亮氨酸，分别得到纯度到D-和L-叔亮氨酸。1992年，Ogura等以(R)-苯甘氨醇为手性诱导剂(Bull.Chem.Soc.Jpn，1992，69，2359-2365)与特戊醛发生不对称Strecker反应，引入手性中心，不对称合成了(S)-叔亮氨酸，总收率达56％，e.e值达100％。

在生物合成法中，专利EP0141223(1985)等发现用固定在苯酚树脂上的青霉素G酰化酶(PGA)可选择性水解N-苯乙酰-(R，S)-叔亮氨酸生成(S)-叔亮氨酸。去除酶后，将溶液酸化到pH3，再浓缩除去苯乙酸和N-苯乙酰-(R)-叔亮氨酸后，用乙醇和水萃取得到(S)-叔亮氨酸，收率达96％。专利DE 9529211.1报道了利用(RS)-5-叔丁基海因为底物，经(R)-海因酶作用开环生成中间体N-氨甲酰-(R)-叔亮氨酸，最后在硝酸溶液(pH0) 作用下脱去氨甲酰，生成R-叔亮氨酸，收率达85.5％，e.e99.5％。专利US6949658报道了消旋的叔亮氨酰胺，在水为溶剂、碱性条件下，经肠道菌酶拆分得到(S)-叔亮氨酸和(R)-叔亮氨酰胺，浓缩母液，向其加入适量有机溶剂(异丙醇或DMF)，搅拌冷却，不需分离即可直接得到结晶的(S)-叔亮氨酸，可达到92％的收率。黎舒婷等利用可以产生亮氨酸脱氢酶(LeuDH)的重组大肠杆菌作为催化剂(药物生物技术，2009，16(3)：202～206)，将底物三甲基丙酮酸转化为(S)-叔亮氨酸，并且在转化体系中加入可以产生甲酸脱氢酶(NAD⁺)的重组大肠杆菌，把这两种菌混合后进行全细胞转化，通过分批加入底物的方法，最终产物(S)-叔亮氨酸浓度为42mg/mL(42g/L)，转化率为82％。专利CN1934264A公开了德国Degussa公司利用亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶全细胞得到(S)-叔亮氨酸，e.e.值为99％。该工艺初始底物浓度低于500mM(约65g/L)，总浓度为1.0M(130.1g/L)，加入外部辅因子的总量少于0.0001底物当量，转化率为96％。专利CN102352387A公开了尚科生物利用固定化全细胞催化剂制备非天然氨基酸的方法，该细胞为重组细胞，重组细胞中含有甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因。产物后处理采用溶剂萃取和重结晶的方法。

本发明利用高表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌，以三甲基丙酮酸为底物，一步转化得到L-叔亮氨酸。采用自诱导系统高密度培养发酵工艺，通过连续流加底物三甲基丙酮酸方法，使底物浓度大于130g/L，转化率达到90％以上。转化液经过交换树脂柱层析和重结晶，产品纯度大于99％。该方法选择性高、纯度高、条件温和、成本低和污染小，具有重要的经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物合成法制备高纯度L-叔亮氨酸的方法。