[发明专利]一种分程胚胎培养液及其配制方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体地说涉及一种提高体外受精卵生长发育效果的分程胚胎培养液及其配制方法。

背景技术

自从世界上第一个“试管”婴孩于1978年7月25日在英国出生后，到2012年7月1日已有500万个“试管”婴孩诞生。IVF（体外受精）为全球超过占5000万不孕症夫妇带来了福音。然而，三十多年的临床实践并没有显著提高IVF的成功率。2011年，美国妊娠协会统计35岁病人IVF成功率（受孕率）在25-30%左右，而1997年也在30%左右。而婴儿出生率更低。其中一个重要的原因是IVF胚胎培养液的质量。这是IVF胚胎质量最重要的决定性因素之一。

IVF培养通常分为两种流程即两种培养液系列：全程（单培养液系列）和分程（双培养液系列）。利用双培养液系列流程对胚胎早期和后期阶段提供不同的培养液成份，但也丢失了由胚胎分泌入培养液中的重要的有效成份，如胚胎营养因子。全程培养液系列流程保留了这些重要的有效成份，但也保留了培养液中有害的分解产物。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供加入多种胚胎营养因子的分程胚胎培养液，本发明的另一个目的是提供上述分程胚胎培养液的配制方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种分程胚胎培养液，包括基本培养液和胚胎营养因子，其中，所述基本培养液包括无机盐缓冲液、氨基酸、丙酮酸钠、乳酸钠、葡萄糖和血清白蛋白；

所述胚胎营养因子包括PAF、IGF-1和GM-CSF的任意一种或多种。

对于本发明涉及的胚胎营养因子，PAF（Platelet-Activating Factor）是植入前期胚胎分泌的磷脂质，在应用中，主要作用在2-细胞期胚胎。PAF可诱导2-细胞胚胎中转录CREB（cAMP-Response element binding protein，cAMP反应元件结合蛋白）的磷酸化，并进一步诱导2-细胞胚胎表达有利于胚胎细胞生存的转录因子和CREB-靶向的转录因子。另一方面，PAF激活MDM2，促使其与细胞核的P53结合成复合物，在细胞浆内将P53降价，从而抑制胚胎细胞的凋零。

IGF-1是IGF（Insulin-like Growth Factors）胰岛素样生长因子中的一种，又被称作“促生长因子”，是一种植入前期胚胎分泌的活性蛋白多肽物质。GM-CSF（Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子），可由卵巢，输卵管，子宫内膜的上皮细胞产生，人类卵子和植入前期胚胎存在GM-CSF受体。起到抑制胚胎细胞凋零，提高胚胎发育的作用。

以上胚胎营养因子在培养液中，可促使受精卵生长发育，生成的囊胚期胚胎具有更高的胚胎干细胞多能性，胚胎干细胞生物学指标UTF1和NANOG的表达量比在无胚胎营养因子的胚胎培养液所生成的囊胚期胚胎明显增高。

本发明采用的是分程培养液，即双程培养液，包括卵裂液培养液和囊胚液培养液。所述卵裂液和囊胚液的无机盐缓冲液都包括如下组分：氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠和EDTA二钠。

具体地说，无机盐缓冲液中所述氯化钾与氯化钠的摩尔比为1.8~2.2:100；所述磷酸二氢钾与氯化钠的摩尔比为0.3~0.4:100；所述氯化钙与氯化钠的摩尔比为1.6~1.8:100；所述硫酸镁与氯化钠的摩尔比为0.18~0.22:100；所述碳酸氢钠与氯化钠的摩尔比为20~30:100；所述EDTA二钠与氯化钠的摩尔比为0.01:100。

作为本发明的最优方案，无机盐缓冲液中氯化钾与氯化钠摩尔比为2:100；磷酸二氢钾与氯化钠摩尔比为0.35:100，氯化钙与氯化钠摩尔比1.71:100，硫酸镁与氯化钠摩尔比为0.2:100，碳酸氢钠与氯化钠摩尔比为25:100，EDTA二钠与氯化钠摩尔比为0.01:100。从而使缓冲液维持在pH7.3~7.5之间，有利于体外胚胎的生长发育。

其中，对于卵裂液培养液，所述胚胎营养因子由PAF、IGF-1和GM-CSF组成，用于配制受精卵体外生长至8-细胞期的卵裂液培养液。

进一步的，对于卵裂液培养液，所述PAF浓度为20ng/毫升，所述IGF-1浓度为2ng/毫升；所述GM-CSF浓度为2ng/毫升。所述乳酸钠和氯化钠的摩尔比为10.5:100；所述丙酮酸钠和氯化钠的摩尔比为0.32:100；所述葡萄糖和氯化钠的摩尔比为0.5:100。每毫升基本培养液含有3mg血清白蛋白。