[发明专利]一种基因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种基因测定方法，尤其涉及一种利用PCR技术和RT-PCR技术对基因组多拷贝基因拷贝数的快速批量测定方法。

背景技术：

拷贝数目变异(copy-number variant，CNV)也称拷贝数目多态(copy-number polymorphism，CNP)，是一种大小介于1kb至3Mb的DNA片段的变异，在人类基因组中广泛分布，其覆盖的核苷酸总数大大超过单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的总数，极大地丰富了基因组遗传变异的多样性，CNV对于物种特异的基因组构成、物种的演化和系统发育以及基因组某些特定区域基因的表达和调控可能具有非常重要的生物学意义，已有研究发现，CNV发生的频率远远高于染色体结构变异，而且在整个基因组中覆盖的核苷酸总数大大超过SNP的总数，由此，研究者们认为，CNV可能和表型变异紧密关联，同时在物种的演化和发展中发挥着重要作用，同时，研究者们还认为此类变异是基因组中最主要的变异，是导致个体间表型差异及各种遗传性疾病和疾病易感性的主要原因，如自闭症(autism)，精神分裂症(schizophrenia)和克罗恩病(Crohn′s disease)的致病机理就是因为正常的多拷贝基因拷贝数突然改变，导致疾病的发生，所以对生物体多拷贝基因拷贝数的快速、准确测定可以对人类某些疾病的诊断和治疗提供生物学方法以及对生命科学中相关现象的生理机制研究提供科学手段。

现行测定基因拷贝数的方法主要有：1、基因组测序法：是通过多种测序方法对整个基因组的所有基因序列进行测定，将得到的序列与目的基因序列进行比对分析，从而得到目的基因的拷贝数；2、基因芯片技术：就是通过微阵列技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的基因探针有规律地排列固定于2cm²的硅片、玻片等支持物上，构成一个二维DNA探针阵列，当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出目标基因的拷贝数；3、DNA复性动力学法：是指DNA经热变性，再恢复(重新复性)过程的动力学分析，按DNA复性速度的快慢，将真核生物的DNA分为单一顺序、中度重复顺序和高度重复顺序三类不同的基因组织，从而得到目的基因的拷贝数；4、生物杂交法：将转基因动植物个体和非转基因动植物个体相互杂交，根据子代中转基因动植物个体的数量和孟德尔定律，推算出目标基因在转基因动植物个体中的拷贝数；5、Southern印迹法：将转基因个体的DNA用限制性内切酶水解，然后用琼脂糖凝胶电泳将DNA按片段大小分开，再将其转移到硝酸纤维或尼龙膜上，将目标基因用放射性同位素或其他方法标记，然后和印到膜上的DNA杂交，根据放射性条带的数值，推断出目标基因的拷贝数；6、荧光定量法：实时PCR又称TapMan PCR，它用一对基因的PCR引物和探针以及DNA聚合酶，通过反复的热冷循环，使目标基因以指数形式扩增，由于PCR产物可以用荧光信号来定量，而且荧光阈值循环数(Ct)与被扩增基因的起始浓度对数是直线负相关的，因此可以用目标基因和已知内参基因来确定目标基因的拷贝数。