[发明专利]胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体及制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种非病毒药物载体材料。特别涉及胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体及制备方法和用途，具体是由平均分子量2kD-20kD的功能化线性聚（酰胺-胺）与胆固醇通过酰胺键或酯键化学偶联形成功能化线性聚（酰胺-胺）-胆固醇梳状嫁接物，临界胶团浓度>1mg/L，可在水相介质中自组装形成纳米颗粒，粒径介于20-200nm，纳米颗粒表面带正电荷，胆固醇接枝率为10％-90％。该纳米颗粒可用于包载化学药物、基因药物和多肽蛋白药物递送。

技术背景

基因输送的成功依赖于安全有效的输送载体。输送载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有转染率高的优点，但其因载药量低、不易工业大规模生产、细胞特异性差、存在免疫原性等缺点限制了其在基因输送系统的应用前景。同时，病毒载体输送基因治疗导致婴儿免疫缺陷的临床病例已有报道（Nature,427,779-781，2004），这引起严重的临床用药安全的顾虑。病毒载体的这一缺陷也间接地推动了非病毒载体的发展。

非病毒载体一般包括，阳离子脂质体、阳离子聚合物、无机阳离子载体等。在阳离子聚合物载体中，目前常用的有聚乙烯亚胺（PEI）、树状大分子、聚赖氨酸（PLL）和壳聚糖等材料。

基因药物(如质粒DNA，siRNA等)通常具有分子量大、亲水性强、荷负电且易于被核酸酶降解破坏的性质，在实际应用中，裸基因药物通常表现出较低的细胞转染能力和非常差的基因治疗效果。通常需要与阳离子材料形成纳米级的静电复合物，从而使其具有较好的细胞摄取能力、较高的稳定性以及较好的基因治疗效应。

近年来，许多科学家致力于具有非免疫原性的阳离子聚合物类非病毒基因载体研究。这些聚合物多为通过化学合成的多氨基结构，包括聚氨基酸和多聚乙烯亚胺等。聚乙烯亚胺（PEI）作为输送载体广泛地应用于pDNA，siRNA，ODN等基因的递送。由于其强正电性能够高效的压缩siRNA，形成纳米级的静电复合物。其多氨基结构（伯胺25％，仲胺50％，叔胺25％）产生的“质子海绵效应”能够使复合物逃逸溶酶体的降解，所以PEI被称作是基因输送载体的“金标准”。然而，这些载体材料的主要问题是低浓度时转染效率低，而高浓度时存在明显的细胞毒性，这一缺点限制其在体内外的广泛应用。

具有氨基结构、安全低毒，并具有体内抗核酶作用的聚阳离子可生物降解材料最近颇受人们关注，国内外研究人员已开展了很多创新载体的设计。很多研究表明含有二硫键(s-s)的聚胺化合物因其在细胞内还原性环境二硫键容易断裂，有利于静电复合物的解组装，从而更好地在细胞浆中释放基因药物，由此产生较高的基因输送效率。另外含二硫键(s-s)的聚合物具有可生物降解、生物相容性好、细胞毒性低，并具有氧化-还原敏感释放基因药物的优势。我们课题组也曾合成并利用含二硫键聚酰胺-胺材料来包载和递送siRNA，研究显示这种材料具有良好的氧化还原酶敏感性，在细胞毒性和siRNA包载保护效应等方面，具有其独特的优势，但转染效率不高的问题依然存在[Int J Nanomedicine2012；7：3837-49]。

胆固醇是一种内源性生理物质，具有良好的生物相容性，近年来，有很多学者利用胆固醇化学偶联与亲水性聚合物链段形成两亲性载体材料，并可在水溶液中自组装形成纳米颗粒。如胆固醇修饰的聚乙烯亚胺（PEI2kD）因为形成稳定的胶束而提高载体的细胞摄取，在pDNA的输送系统中取得很高的输送效率（JControl Release2007；118：357-63）。也有学者报道通过形成季铵盐的方式将胆固醇接枝于阳离子载体也能取得了良好的基因输送效率（Biomaterials2007；2835：5358-68）。这些已报道的两亲性载体材料中，亲水聚合链片段多为生物不可降解材料，尽管采用胆固醇修饰，但在利用这些材料递送基因药物时仍然表现出转染效率不高且具有较大毒性的问题。

发明内容

本发明提供了胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体的制备方法及其用途。本发明的载体，是由平均分子量2kD-20kD的功能化线性聚（酰胺-胺）与胆固醇通过酰胺键或酯键化学偶联形成的。

其中所述线性聚（酰胺-胺）是由N，N′-双(丙稀酰)胱胺（cystamine bisacrylamide，CBA)）与含-NH₂单体通过迈克尔加成（Michael addition）反应聚合形成的具有重复单元的线性聚合物，且聚合物中每个单元结构中均含有二硫键。该聚合物属于现有技术，其结构如下：