[发明专利]一种能降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母

说明书

技术领域

本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，更具体地，涉及一种能降解无定形纤

维素的基因重组酿酒酵母。

背景技术

目前车用燃料乙醇几乎都是用粮食玉米等为原料生产，大量生产燃料乙醇势必会带来与人争粮的问题，会加剧世界粮食短缺的危机。解决方式是尽量由纤维素（Cellulose）生产乙醇而避免用淀粉和糖类来生产乙醇。纤维素是自然界中存在最广泛的碳水化合物，也是地球上数量最多的可再生资源。在我国，每年植物秸秆等纤维素类物质总量达7亿吨，但目前大部分采用焚烧处理，造成了严重的环境污染和资源浪费。用来源广泛、价格低廉的农林废弃物替代粮食为原料来生产燃料乙醇是一个重点的发展方向，已经被认为是发展循环经济的有效途径。

纤维素分子是由D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键相联结而成的高分子化合物。利用纤维素生产乙醇的前提是把纤维素有效地水解为葡萄糖。因此，一直以来人们都在寻求降解纤维素的有效方法。目前形成了包括物理方法、酸水解法和酶水解法在内的几种主要处理手段。物理方法既无法完全破坏纤维素的结构，又能耗巨大。酸水解法会造成环境污染，且分解后的产物回收率不高。酶水解法即用纤维素酶进行酶处理的过程，具有反应条件温和，副产物少的特点，被认为是比较有效且更接近自然的一种方法，分解后的产物较易被回收利用，而且污染低。因此，利用低耗能、低污染的生物技术，尤其是微生物发酵法对纤维素进行生物转化是近年来的研究热点。

无定形纤维素是聚合度低、结构疏松的纤维素，较容易被试剂渗透，水解较快。无定形纤维素来源广泛，可从农业纤维素废弃物制得。它能被内切β-1,4-葡聚糖酶（Endo β-1,4-glucanase，EG）随机切断β-1,4-糖苷键，生成大量带非还原性末端的小分子纤维素片段；这些小分子纤维素片段又能被β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase，BGL）进一步降解，最终水解成为葡萄糖分子。因此将内切β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶两种酶结合，就能直接降解无定形纤维素，生成葡萄糖。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是工业上乙醇发酵的首选菌种，具有利用葡萄糖合成乙醇的能力，但缺乏有效降解纤维素生成葡萄糖的酶，因此在自然条件下不能直接利用纤维素类物质发酵产生乙醇。若能将上述两种酶的基因导入酿酒酵母，以基因工程手段弥补酿酒酵母纤维素降解能力的缺陷，就可实现利用无定形纤维素发酵生产燃料乙醇的目的，对于解决粮食危机、能源危机均具有重要的指导意义。专利（CN 101319196）中公开了一种能同时分泌表达EG、CBH及BGL的重组酵母，虽然也能够利用无定形纤维素为原料进行乙醇发酵，但是需要在酿酒酵母菌中种同时转入EG、CBH及BGL三种酶基因，构建工艺相对复杂，三种酶基因之间的表达调控也相对复杂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能

降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母。

    本发明所要解决的另一技术问题是，提供一种能降解无定形纤维素的基因重

组酿酒酵母的构建方法。

本发明的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种能降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母，该基因重组酿酒酵母是将内切β-1,4-葡聚糖酶（EG）基因和β-葡萄糖苷酶（BGL）基因通过酿酒酵母表达载体同时转入酿酒酵母并获得正确的分泌表达而构建成的。

作为一种优选方案，所述的酿酒酵母表达载体为酿酒酵母多基因共表达载体。

作为一种优选方案，所述酿酒酵母多基因共表达载体为载体pScIKP（专利ZL 2008 1 0029630.6）。

一种能降解无定形纤维素的基因重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：

S1.将内切β-1,4-葡聚糖酶基因（EG）和β-葡萄糖苷酶基因（BGL）接入酿酒酵母表达载体中，构建重组双基因共表达载体；

S2.将上述构建得到的重组双基因共表达载体用限制性内切酶切割，使之线性化后转化到酿酒酵母中，构建转基因酿酒酵母。

作为一种优选方案，S1构建重组双基因共表达载体包括如下步骤：

S11.分别将内切β-1,4-葡聚糖酶基因（EG）和β-葡萄糖苷酶基因（BGL）进行PCR扩增；

S12.用限制性内切酶分别切割载体、内切β-1,4-葡聚糖酶基因（EG）和β-葡萄糖苷酶基因（BGL）；

S13.将内切β-1,4-葡聚糖酶基因（EG）和β-葡萄糖苷酶基因（BGL）接入酿酒酵母表达载体中。