[发明专利]一种用于水质生物毒性快速检测的发光菌试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及一种能够快速现场检测水体生物毒性的发光菌试纸，并提供了该试纸的制备方法。

背景技术

随着工业化程度的升高以及各类化工产品污染水体事件的突发，各种化学物质数量猛增，给人类生存环境造成很大影响，迫切需要对日益增多的环境污染物进行急性毒性鉴定。传统的化学分析方法能准确定量分析污染物中主要成分的含量，但不能直接而又及时地反映各种有毒物质对环境和生物的综合影响。传统的动物毒性实验以哺乳类、鱼类等为受试对象，虽然能反映毒物对生物的直接影响，但方法繁琐，实验周期长，不满足水质急性毒性检测的需求。针对传统毒性检测方法的不足，目前国内外研究者建立了各种各样的生物实验方法，包括微生物、藻、底栖软体动物、浮游生物、鱼等，用来监测环境污染物对水生生物的毒性，其中发光菌因其独特的生理特性，与现代光电检测手段完美匹配的特点而倍受关注。 

发光菌最特别的生理代谢特征是在其生长的一定时间内，能够发射可见光，简单来说，细菌发光可概括如下： 

细菌身体内可以合成一种酶，该酶可以催化还原型的黄素单核苷酸（FMNH₂）和长链脂肪醛（RCHO，至少含8个C）并在O₂的参与下发生氧化反应而放出光子。该氧化反应并不放热，所以发光菌发出的是典型的“冷”光。

发光波长在490nm左右。这种发光过程极易受到外界条件的影响，凡是干扰或损害细菌呼吸或生理过程的任何因素都能使细菌发光强度发生变化。当有毒有害物质与发光菌接触时，发光强度立即改变，并随着毒物浓度的增加而发光减弱。利用发光菌遇到毒性物质即减弱发光这一特性，可以快速而又相对准确地测试出水体的生物急性毒性。

水凝胶（hydrogels）是一种亲水性但不溶于水的高分子聚合物,是一类集吸水、保水、缓释于一体并且发展迅速的功能高分子材料。水凝胶具有独特的吸水、保水及仿生特性，因而被广泛应用于工业、农业、医药和生物工程材料领域。水凝胶还具有优良生物相容性，亲水性的水凝胶与被固定的酶或细胞的相互作用极弱，固定在水凝胶中的生物分子的活性能够长时间保持。目前水凝胶已成功应用于固定哺乳动物细胞、DNA杂交分析等等。

但是，目前还未见将发光细菌固定在水凝胶中，用于快速水体生物毒性的的报道。

将发光细菌固定在水凝胶中，使得整个检测过程更为简便，测量结果更为稳定，由于细菌被固定在水凝胶中，因而对外界的条件变化适应性更好。此外由于试纸的便携性，检测时可将试纸直接投入待测水样中，待反应时间结束后将试纸拿出然后进行发光度检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速现场检测水体生物毒性的发光菌试纸。该试纸同现行的检测技术相比具有稳定、低价、便携和灵敏性更高的特点。

本发明提供的能够快速现场检测水体生物毒性的发光菌试纸，以普通试纸材料为基底，通过水凝胶包裹发光菌，在紫外灯的照射下凝固为固态，从而将发光菌固定在试纸上而得到。该发光菌试纸放于-20oC冰箱保存，待用。

本发明提供的发光菌试纸的制备方法，具体步骤如下：

（a）准备试纸基底，裁剪成需要的尺寸；

（b）将发光菌菌粉和水凝胶按混合；

（c）将发光菌菌粉和水凝胶的混合物滴加于试纸基底上；   

（d）将试纸置于紫外灯下照射固定。

本发明提供的发光菌试纸的用于检测的方法如下：将发光菌试纸放入2%的氯化钠溶液进行复苏，（约13--18分钟）复苏完毕后，将发光菌试纸投入待测水体，检测发光菌试纸上发光菌的初始发光量和15分钟（或30分钟）后的发光量，对比得出抑光率，从而实现对该水体生物毒性的检测。 

本发明中，用于凝固试纸上水凝胶和发光菌的紫外灯，可选用一般市面上售卖的便携式手提紫外灯即可。用于检测发光菌试纸上发光菌的发光量的装置选用杭州绿洁公司的光子探测仪。

本发明中，水凝胶可选用聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），并用2-羟基-2-甲基苯基苯酮（HMPP）作为光引发剂 ，其中光引发剂为水凝胶体积的4%-6%，优选5%；菌种：费氏弧菌冻干粉（Vibrio fischeri），市售的一般费氏弧菌冻干粉都可以满足实验要求。该实验在一般常温条件下即可进行。

本发明中，发光菌菌粉和水凝胶的混合物的用量比例范围为：3~4mg菌粉和100uL的水凝胶混合。

本发明中，紫外灯下照射固定时间为8—15秒。

本发明提供的发光菌试纸，大小可为10cm×1cm。