[发明专利]基因重组人胶原蛋白

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组胶原蛋白及其生产方法。 

背景技术

胶原蛋白是一种生物高分子物质，是维持肌肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要物质。主要存在于人和动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织中重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原蛋白对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必需的养分，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增加循环，达到滋润皮肤延缓老化，美容，消皱，养发的目的。 

生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱或酶来处理动物组织（猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮/鳞等），从中提取胶原蛋白。这些方法虽然成本低廉、回收率较高，但是制取的胶原蛋白均为分子量很小且长度不等的混合胶原蛋白肽段，俗称明胶，很难起到保湿、滋养的效果；提取工艺简单粗放，产物纯度不佳，常有异味；动物来源，无法摆脱生物安全隐患，极大的限制了传统胶原在化妆品、食品、药品等各类产品中的广泛应用；加工提取时产生巨量废水严重伤害环境；技术门椹低，原料来源不易控制，造成皮鞋奶、毒胶囊横行，食品、药品安全隐患严重。 

为了解释传统动物胶原的一系列问题，许多学者开始着手应用生物技术来生产重组胶原，因微生物培养的种种便利，利用重组微生物生产胶原逐渐成为主流。产业化生产的，如范代娣应用大肠杆菌高密度发酵培养生产的重组类人胶原蛋白，并已成功应用到化妆品领域。但是细菌表达体系具有内毒素、热原等生物安全问题，使得产品的生产、检测成本高企，并存在隐患；表达的蛋白以包涵体形式存在细菌细胞内，产物纯化困难、回收率受限制；另外原核表达系统比较低级，不能完成表达产物的翻译后加工修饰，使产物不具有生物活性。 

因此，越来越多的学者开始利用真核微生物生产重组胶原：张凤龙等利用毕赤酵母合成几乎完全人源性的重组胶原，应用于化妆品。但其纯化方法仅采用了超滤、凝胶过滤、离子交换等传统非特异性的大分子分离技术，纯度不够高，杂蛋白和部分降解蛋白无法彻度去除，满足不了微创美容、整形美容对纯度的更高要求。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有重组胶原及其制备技术的不足，提供一种真核工程菌生产的完全人源化的重组胶原，其性能远优于动物胶原蛋白、原核微生物重组胶原；同时带有特异性亲和纯化标记，易于得到高纯度产品。 

基因重组人胶原蛋白全长474个氨基酸，由两段完全相同的人Ⅲ型胶原片段串联而成，C末端连接6个组氨酸残基，其序列（SEQ ID NO.1）如下： 

AGNTGAPGSP　GVSGPKGDAG　QPGEKGSPGA　QGPPGAPGPL　GIAGITGARG　50 LAGPPGMPGP　RGSPGPQGVK　GESGKPGANG LSGERGPPGP　QGLPGLAGTA　100 GEPGRDGNPG　SDGLPGRDGS　PGGKGDRGEN　GSPGAPGAPG　HPGPPGPVGP　150 AGKSGDRGES　GPAGPAGAPG　PAGSRGAPGP QGPRGDKGET　GERGAAGIKG　200 HRGFPGNPGA　PGSPGPAGQQ　GAIGSPGPAE   FTAGNTGAPG　SPGVSGPKGD　250 AGQPGEKGSP　GAQGPPGAPG　PLGIAGITGA   RGLAGPPGMP　GPRGSPGPQG     300

VKGESGKPGA　NGLSGERGPP　GPQGLPGLAG　TAGEPGRDGN　PGSDGLPGRD　350 GSPGGKGDRG　ENGSPGAPGA　PGHPGPPGPV　GPAGKSGDRG　ESGPAGPAGA　400 PGPAGSRGAP　GPQGPRGDKG　ETGERGAAGI　KGHRGFPGNP　GAPGSPGPAG 　450 QQGAIGSPGP　ADHHHHHHTG　LARF                                                                       　　 474

蛋白为单链结构，其中1～229和233～461为相同的Ⅲ型胶原肽段，两段人Ⅲ型胶原蛋白片段之间有EFT连接，233～461的人Ⅲ型胶蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF进行修饰，其中463～468为亲和纯化标记6His。

 生产上述蛋白的基因重组工程菌及蛋白制备方法由下述步骤组成： 

（一）、重组表达载体的构建