[发明专利]基因重组人胶原蛋白

权利要求书

1.一种人源化基因重组胶原蛋白，其特征是序列如下：蛋白全长474个氨基酸，其中1～229和233～461为相同的人Ⅲ型胶蛋白原片段，两段人Ⅲ型胶原蛋白片段之间有EFT连接，233～461的人Ⅲ型胶蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF进行修饰；其氨基酸序列如下：（SEQ ID NO.1）

AGNTGAPGSP　GVSGPKGDAG　QPGEKGSPGA　QGPPGAPGPL　GIAGITGARG　50 LAGPPGMPGP　RGSPGPQGVK　GESGKPGANG LSGERGPPGP　QGLPGLAGTA　100 GEPGRDGNPG　SDGLPGRDGS　PGGKGDRGEN　GSPGAPGAPG　HPGPPGPVGP　150 AGKSGDRGES　GPAGPAGAPG　PAGSRGAPGP QGPRGDKGET　GERGAAGIKG　200 HRGFPGNPGA　PGSPGPAGQQ　GAIGSPGPAE   FTAGNTGAPG　SPGVSGPKGD　250 AGQPGEKGSP　GAQGPPGAPG　PLGIAGITGA   RGLAGPPGMP　GPRGSPGPQG     300

VKGESGKPGA　NGLSGERGPP　GPQGLPGLAG　TAGEPGRDGN　PGSDGLPGRD　350 GSPGGKGDRG　ENGSPGAPGA　PGHPGPPGPV　GPAGKSGDRG　ESGPAGPAGA　400 PGPAGSRGAP　GPQGPRGDKG　ETGERGAAGI　KGHRGFPGNP　GAPGSPGPAG 　450 QQGAIGSPGP　ADHHHHHHTG　LARF　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 474。

2.一种生产权利要求1所述蛋白的工程菌，其特征在于该工程菌由下述步骤获得：

（1）克隆人Ⅲ型胶蛋白基因

从人新鲜胎盘中提取总RNA，反转录为cDNA，根据GenBankⅢ型人胶原蛋白COL3A1基因序列，设计基因PCR扩增引物F、R：

（SEQ ID NO.2）F: GAATCTGTGAATCATGCCCTAC

（SEQ ID NO.3）R: GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT

以cDNA为模版扩增得到基因片段，产物长度为3295bp；

（2）构建质粒pPIC9K-COL3-COL3-6His

利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说明书，从普通的1.5%琼脂糖凝胶上回收特异性条带COL3A1；依照pGM-T克隆试剂盒说明书，将COL3A1连接于pGM-T载体上，得到质粒pGM-T-COL3A1；以pGM-T-COL3A1质粒为模板，以F1、F2、R为引物进行多重PCR扩增，得到产物COL3长度为722bp，引物为：

（SEQ ID NO.4）F1:AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG

（SEQ ID NO.5）F2:TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT 

（SEQ ID NO.6）R: TTGAATTCTGCAGGTCCTGG

将产物COL3和质粒pPIC9K分别做EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为质粒pPIC9K-COL3；

以质粒pPIC9K-COL3为模板，再次扩增COL3得到COL3-6His，引物为：

F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGC （SEQ ID NO.7）

R:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG（SEQ ID NO.8）

将二次扩增产物COL3-6His和质粒pPIC9K-COL3分别进行EcoRI、AgeI双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为质粒pPIC9K-COL3-COL3-6His；

（3）基因重组构建表达人Ⅲ型胶蛋白的毕赤酵母基因工程菌

将制备得到的质粒pPIC9K-COL3-COL3-6His用限制性内切酶SalⅠ线性化，并制备毕赤酵母SMD1168（Invitrogen）感受态细胞，电击转化pPIC9K-COL3-COL3-6His质粒，以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，得到毕赤酵母基因工程菌。