[发明专利]一株肿瘤靶向细菌及其菌剂制备方法与代谢产物

权利要求书

1.一株肿瘤靶向细菌，其特征在于，是昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01，Xenorhabdus stockiae HN_xs01；该菌种于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2012069。

2.一株制备如权利要求1所述肿瘤靶向细菌菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌种活化，将保藏于-80℃冰箱中的昆虫病原线虫共生致病杆菌 HN_xs01划线接种于NBTA培养基上，30℃条件倒置培养36~48 h；然后挑取单菌落划线，以作进一步的纯化；

(2) 一级发酵培养和二级种子罐发酵培养：挑取经再次纯化后的Xenorhabdus stockiae HN_xs01接种LB液体培养基中，30℃下180~200 rpm振荡培养12h至对数生长中期，然后将10 mL培养液接种于1000 mL LB液体培养基中，30℃下180~200 rpm振荡培养12~24h，得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃下灭菌30min，装入发酵罐培养基后再灭菌，冷却至25~30℃，将一级种子罐发酵液按体积比4％～5％接种量接入二级种子罐，通入无菌空气1.8立方米/小时，并以180 rpm的速度搅拌进行培养，培养12～24 h，得二级种子罐发酵菌液；

(3) 生产用发酵罐培养，先将发酵罐灭菌，121℃，压力1.2-1.3 kg/cm²条件下灭菌30min，装入发酵罐培养基后再以121℃条件灭菌25 min，保压降温至25℃～30℃，按体积比4％～5％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通入无菌空气，通气量3升/分钟，温度30℃，搅拌转速为200 rpm，培养36 h；

(4)制备制剂：当菌体的发酵液密度≥20g^.L^-1，菌体量不足1020g^.L^-1时放罐，收集菌液，11000 rpm，2 min离心收集菌体，生理盐水洗涤6-8遍，先使微生物在极低温度-70℃下快速冷冻，然后在真空度-0.1Mpa下真空干燥，除去水分，真空包装在玻璃瓶中，-20℃保藏，即成；

所述培养基的配方及制备：

LB液体培养基配方：蛋白胨10 g^.L^-1，NaCl 10 g^.L^-1，酵母提取物5 g^.L^-1，水溶，灭菌前pH值7.0～7.4，121℃，20 min条件湿热灭菌；

NBTA培养基配方：营养琼脂45 g，红四氮唑0.04 g，溴麝香草酚蓝0.025 g，容于1 L单蒸水中，121℃，20 min条件湿热灭菌；

发酵罐培养基配方：蛋白胨20g^.L^-1，酵母浸粉12g^.L^-1，NaCl 10 g^.L^-1，葡萄糖13.7 g^.L^-1，K₂HPO₄ 2.3 g^.L^-1，KH₂PO₄ 1.5 g^.L^-1，MgSO₄^. 7H₂O 0.25 g^.L^-1，水溶，pH值7.0～7.4。

3.一种如权利要求1所述肿瘤靶向细菌的具有较高抗肿瘤活性的次级代谢产物为苯乙酰胺类衍生物和大环内酯类化合物，分别命名为长沙霉素A、长沙霉素B、长沙霉素C和长沙霉素D，分子结构如下所示：

所述长沙霉素A质荷比m/z 843、长沙霉素B质荷比m/z 785、长沙霉素C质荷比m/z 672和长沙霉素D质荷比m/z 560。