[发明专利]一种利用嗜热子囊菌内切β-1,4-葡聚糖酶降解壳聚糖制备壳寡糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，属于酶工程领域。 

背景技术

壳寡糖，学名为β-1，4-寡聚-葡萄糖胺，指2～10个氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖。壳寡糖具有壳聚糖不具备的水溶性和易被生物体吸收等诸多独特优异的功能，在医药、保健、食品、日化、农业等领域具有广泛的应用前景。另据报道，聚合度为3～8的壳寡糖具有较高的生物活性。例如，聚合度为3～7的壳寡糖能够促进钙及其他矿物质的吸收，聚合度为6～8的壳寡糖具有高活性的抗肿瘤作用等。 

目前，壳寡糖的制备方法主要有化学法和酶法水解。化学法主要包括酸降解和H₂O₂氧化降解。化学法反应条件剧烈，且不好控制，降解产物中主要得到的是单糖，具有生理活性的壳寡糖收率低，同时产物中混有大量酸和氧化剂，环境污染严重。 

酶法降解壳聚糖具有条件温和，易于控制，壳寡糖收率高，污染少等优势而被广泛关注，酶解法又分为专一性酶解法和非专一性酶解法。壳聚糖酶是壳聚糖的专一性水解酶，Takiguchi等用来源于Bacillus sp.7-M的壳聚糖酶降解壳聚糖成功地得到了二至五糖，shimai等人用壳聚糖酶结合膜过滤技术水解壳聚糖，得到五糖含量＞92.3％的壳寡糖。 

降解壳聚糖的非专一性酶种类很多，主要有纤维素酶，溶菌酶，脂肪酶，蛋白酶等。研究较多的为纤维素酶。Muraki等研究了来源于里氏木霉的纤维素酶对壳聚糖的降解作用。在50℃条件下用浓度为0.6％的纤维素酶作用于浓度为3％的壳聚糖，最佳水解时间为6小时，产物中聚合度5～8的壳寡糖占18％。Zhang等应用纤维素酶结合膜分离技术生产出了聚合度3～10的壳寡糖。 

近年来，随着壳寡糖产业的不断发展，壳寡糖的市场需求量日益增大，但是，由于来源有限，难以获得大量而廉价的壳聚糖专一性酶，因此寻找用于降解壳聚糖的非专一性酶，并建立一种快速，环保，高效 的壳寡糖制备方法显得尤为重要。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效廉价降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，即利用嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)或者基因工程菌生产的内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A降解壳聚糖，得到壳寡糖。 

本发明提供的一种高效廉价降解壳聚糖制备壳寡糖的方法步骤为： 

(1)以1～2％醋酸溶液溶解壳聚糖，配制成浓度为1～6％的壳聚糖溶液，然后用10～20mM醋酸钠溶液调节pH至5.0。 

(2)将步骤(1)制得的壳聚糖溶液倒入容器中，置于40～55℃的恒温水浴振荡器中，按2～10IU/g底物的加酶量加入内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A进行酶解反应，反应结束后，将所得的酶解液煮沸，使酶灭活，调pH至8.0后离心，将上清液冷冻干燥制得壳寡糖。 

本发明的优点是：利用纤维素酶生产壳寡糖，生产过程简单，生产成本大幅降低；反应条件温和，能耗低，污染少；酶解效率高，仅需1小时，壳2～8糖转化率达到60％，产物中有效组分含量高，壳3～8糖的含量在77％以上，是生产壳寡糖的理想方法。 

附图说明

图1壳寡糖制备的工艺流程图。 

具体实施方式

实施例1： 

以2％的乙酸溶液溶解壳聚糖，配制成浓度为3％的壳聚糖溶液，然后用乙酸钠溶液调节pH至5.0。将制得的壳聚糖溶液倒入容器中，置于50℃的恒温水浴振荡器中，按2IU/g底物的加酶量加入内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A进行酶解反应，反应一小时后，将所得的酶解液煮沸，使酶灭活，调pH至8.0后离心，将上清液冷冻干燥得到壳寡糖成品。 

所述的壳寡糖产品经高效液相色谱法检测，检测条件为：色谱柱，Asahipak NH2P-50 4E柱(4.6mm*250mm，Shodex公司)；流动相为70％乙腈，流速0.8mL/min；检测器为蒸发光散射检测器；柱温30 ℃，壳2～8糖转化率达到60％，产物中有效组分壳3～8糖含量高，含量在77％以上。 

实施例2： 

以2％的乙酸溶液溶解壳聚糖，配制成浓度为6％的壳聚糖溶液，然后用乙酸钠溶液调节pH至5.0。将制得的壳聚糖溶液倒入容器中，置于50℃的恒温水浴振荡器中，按2IU/g底物的加酶量加入内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A进行酶解反应，反应一小时后，将所得的酶解液煮沸，使酶灭活，调pH至8.0后离心，将上清液冷冻干燥得到壳寡糖成品。