[发明专利]一种从牛冷冻精子中提取蛋白的方法

说明书

技术领域

 本发明属于生物工程技术领域，涉及牛冷冻精液精子质量评定技术，尤其涉及一种从牛冷冻精子中提取蛋白的方法。

 

背景技术

家畜精液的冷冻保存是20世纪以来随着人工授精技术的广泛应用而产生，通过超低温降低或抑制精子新陈代谢的速度，使精子生命在相对静止的状态下保存起来，以延长体外存活的时间。精液冷冻保存技术的应用不仅解决了精液长期保存的问题、便于开展国内外合作与交流，降低人工授精的成本，而且有利于高效利用优秀种公畜的遗传资源，加快遗传进展，加速品种改良，提高家畜的繁殖效率。人工授精技术作为养牛业应用最为广泛的技术之一，虽然目前已经取得了良好效果，但一般的研究仅仅涉及不同稀释液对精液冷冻质量的影响，探求适宜的冷冻稀释液配方。关于稀释液中不同成分提高精子活力的机理，影响精子冻后活力的相关基因、蛋白及其相互作用和表达的信号途径等相对研究较少，由于对其作用机理不甚清楚，从而影响精液品质的进一步提高。

 

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于建立一种从牛冷冻精子中提取蛋白的方法。该提取方法探索最优精液细管数与裂解液搭配比例，从而提高精子蛋白的浓度。

实现上述发明目的的技术方案是，一种从牛冷冻精子中提取蛋白的方法，包括下列步骤：

1）将冷冻精液解冻后转移到离心管中，在4 ℃、1000×g条件下离心5 min，弃上清液；

2）加入1 ml预冷到4℃的PBS洗涤，在4 ℃、1000×g条件下离心5 min，重复3次；

3）向上述沉淀中加200 μl蛋白裂解液（solarbio, RIPA组织/细胞裂解液），用涡旋仪（2800 r/min）涡旋混匀，使样品充分溶解；

4）静置5 min后，在4 ℃、12000 ×g条件下离心30 min，上清即为精子蛋白溶液。

本发明从牛冷冻精子中提取蛋白的提取主要由三个步骤组成，分别是精子的洗涤、精子蛋白的提取和SDS-PAGE精子蛋白的分离，并以HSP90蛋白表达量与牛精子抗冻性关系为例说明精子蛋白浓度达到后续试验要求的水平。假阴道法采集9头牛的精液，测定新鲜精液指标（活力、形态、活率和密度）。精液样品经过冷冻-解冻后检测其品质，并按照冻后精子活力和质膜完整性进行分组，提取精子蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，经Western blot分析，以验证HSP90含量与精子抗冻性的关系。SDS-PAGE电泳显示，不同质量精子蛋白样品中，90 kDa蛋白表达量差异显著（P＜0.05）。Western blot分析验证该蛋白为HSP90，HSP90蛋白的表达量与冷冻-解冻后的牛精子品质具有明显的相关性。此结果表明：通过HSP90的Western blot可以预测不同精子的抗冻性，冷冻-解冻后，精子中HSP90表达量越高精子冻后活力越高，而HSP90表达量越低，其精子冻后活力越低。本发明为将来从分子手段研究精子冷冻保护机理奠定了基础，可以进一步提升精子冷冻后的活力。

附图说明

图1为精子蛋白SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色图谱。

图2 为HSP90蛋白的表达图谱。

下面结合发明人给的具体试验数据和使用方法，进步一步说明本发明的显著效果。

实施例1

1）将冷冻精液解冻后转移到离心管中，在4 ℃、1000×g条件下离心5 min，弃上清液；

2）加入1 ml预冷到4 ℃的PBS洗涤，在4 ℃、1000×g条件下离心5 min，重复3次；

3）向上述沉淀中加200 μl蛋白裂解液（solarbio, RIPA组织/细胞裂解液），用涡旋仪（2800 r/min）涡旋混匀，使样品充分溶解；

4）静置5 min后，在4 ℃、12000 ×g条件下离心30 min，上清即为精子蛋白溶液。

试验例1 以HSP90蛋白表达量与牛精子抗冻性关系进行说明

1.SDS-PAGE精子蛋白的分离

蛋白与SDS-PAGE 上样缓冲液混匀后，在95 ℃煮5 min，取20 μl蛋白样品进行电泳。电泳结束后利用考马斯亮蓝染色，最后用BIO-RAD凝胶成像分析仪对凝胶进行拍照，并用Image Lab软件对蛋白图谱进行分析。