[发明专利]一种培养重组禽流感病毒H5N1亚型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体地涉及一种高密度细胞培养技术培养重组禽流感病毒H5N1亚型的方法。

背景技术

目前，我国重组禽流感病毒H5N1亚型的培养方式主要是9～11日龄健康鸡胚培养，该培养方法是通过将病毒接种到鸡胚尿囊腔中进行病毒繁殖，虽然其操作技术简单且技术成熟稳定，但与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要表现为：（1）生产周期长，难以在短时间内实现大规模的疫苗抗原生产；（2）受鸡胚等原辅材料的限制；（3）生产工艺落后，劳动力密集，生产成本高。我国也有报道采用MDCK细胞培养技术培养重组禽流感病毒H5N1亚型的方法，但绝大多数为转瓶培养，生产效率低下，不能满足实际生产的需求。

专利CN 101979517A公开了一种利用生物反应器大规模生产流感病毒的方法。包括1）将MDCK细胞接种到潮汐式生物反应器载体罐内的载体上，进行细胞的吸附培养；2）进行细胞的扩增培养；3）将H5N3亚型流感病毒接种到扩增培养的细胞上，进行病毒的吸附培养；4）进行病毒的增殖培养；5）在病毒含量达到峰值后，收获含有流感病毒的培养液。而对于重组禽流感病毒H5N1亚型，现有的生产技术均为鸡胚培养，不适合未来发展的需要。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明的目的是提供重组禽流感病毒H5N1亚型大规模培养的方法。

为实现上述目的，本发明利用朝夕式高密度细胞培养系统进行重组禽流感病毒H5N1亚型的大规模培养，该方法包括如下步骤：

（1）将MDCK细胞接种潮汐式高密度细胞培养系统，并加入细胞生长液进行培养。

（2）将所述步骤（1）所得到的细胞接种含重组禽流感病毒H5N1亚型的病毒生长液，进行病毒的培养。

（3）接毒后2～4天收获所述步骤（2）得到的病毒生长液。

其中，上述方法使用的潮汐式高密度细胞培养系统已含细胞培养载体。

所述重组禽流感病毒H5N1亚型包括重组禽流感病毒H5N1亚型Re-1株、重组禽流感病毒H5N1亚型Re-4株、重组禽流感病毒H5N1亚型Re-5株和重组禽流感病毒H5N1亚型Re-6株。

优选的，所述步骤（1）中的潮汐式高密度细胞培养系统为潮汐式高密度细胞培养系统。包括TideCell-010系统、TideCell-020系统和TideCell-100系统等。

该高密度细胞培养系统设计简单，占用空间小，生产效率高，细胞培养密度可达10⁷Cell/ml。

优选的，所述步骤（1）中将所述的潮汐式高密度细胞培养系统和细胞培养载体经消毒灭菌后（或为含细胞培养载体的一次性灭菌反应瓶）接种所述MDCK细胞，并加入细胞生长液进行培养。

优选的，所述步骤（1）中的培养温度为37℃，含CO₂量为5%。

优选的，所述步骤（1）中的细胞生长液含95%体积百分比的DMEM液和5%体积百分比的新生牛血清，所述细胞生长液的PH值为7.0～7.4。

优选的，所述步骤（2）中的培养温度为34℃，含CO₂量为5%。

优选的，所述步骤（2）中接种时的病毒接种量为含禽流感病毒MOI是10^-4～10^-6的病毒生长液。

优选的，所述步骤（2）中的病毒生长液含5μg/ml质量体积比的TPCK处理胰酶、0.2%体积百分比的牛血清白蛋白组分V的DMEM液，所述病毒生长液的PH值为7.0～7.4。

本发明中的重组禽流感病毒H5N1亚型为以流感病毒PR/8的6个内部基因为供体重新构建的一系列的H5N1亚型禽流感病毒。包括重组禽流感病毒H5N1亚型Re-1株、重组禽流感病毒H5N1亚型Re-4株、重组禽流感病毒H5N1亚型Re-5株和重组禽流感病毒H5N1亚型Re-6株。

H5N3亚型为禽流感病毒的另外一种亚型，其在MDCK细胞中的培养条件与重组禽流感病毒H5N1亚型具有明显的区别，在现有的H5N3亚型培养基础上培养重组禽流感病毒H5N1亚型不能达到生产的要求。本发明经过优化病毒接种条件、接种病毒浓度、病毒培养温度等培养条件后，能够符合重组禽流感病毒H5N1亚型的生产需求。