[发明专利]一种花药快速诱导胚性愈伤组织再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于组织培养领域，具体涉及一种通过组织培养诱导葡萄花药形成胚性愈伤组织的方法。

背景技术

建立稳定高频的葡萄再生体系对于优化转基因条件，提高转基因效率，进行葡萄新品种选育和遗传改良具有重要意义。以愈伤组织为受体材料进行基因遗传转化研究具有很多优势。第一，已分化的细胞均回复到脱分化的分生细胞水平，易于接受外源基因，转化效率较高；第二，扩繁量大，获得的转化愈伤组织通过继代扩繁培养，能够分化出更多的转化植株；第三，多种组织、器官均可诱导愈伤组织，外植体试材广泛。目前葡萄再生体系的获得主要通过两条途径：器官再生途径和体细胞胚再生途径。器官再生途径是在外植体上直接形成不定芽、不定根，再生出完整植株，或者外植体经过脱分化诱导产生愈伤组织，愈伤组织在分化培养基上分化从而获得再生植株。该途径再生过程简单，周期短，但是容易产生嵌合体。体细胞胚再生途径是由植物组织直接分化出体细胞胚或者植物组织先诱导产生愈伤组织，愈伤组织经过诱导形成体细胞胚。由花药、花丝、胚珠等器官诱导胚性愈伤组织产生体细胞胚是葡萄再生体系研究中效果最好、应用最广泛的诱导方式。诱导过程存在胚性愈伤组织诱导效率低，伴随着非胚性愈伤组织的出现，培育周期长等，限制了葡萄花药培养在实际育种中的应用。因此提高葡萄胚性愈伤组织的诱导率是葡萄花药培养技术研究中一个关键问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的葡萄花药诱导胚性愈伤组织诱导率低的不足，提供一种高效诱导葡萄花药形成胚性愈伤组织进而再生葡萄植株的培养基配方及诱导方法，通过该方法提高胚性愈伤组织的诱导率，为建立高效的葡萄花药培养植株再生系奠定基础。

本发明通过以下技术方案实现：

葡萄花药快速诱导胚性愈伤组织再生植株的方法：利用酿酒葡萄雷司令花药为材料，进行花药诱导胚性愈伤组织、愈伤组织分化培养、分化苗生根培养、炼苗移栽等步骤完成葡萄植株再生。根据该方法，其特征在于葡萄盛花前12-14天，即花粉四分体到单核期，在天气晴朗的上午摘取花药饱满的花蕾，4℃黑暗保存3天，可以提高胚性愈伤组织的诱导效率；从消过毒的花蕾中取出花药在无菌条件下接种到愈伤组织诱导培养基中，愈伤组织诱导培养基配方为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.2mg L^-1烟酸、150mgL^-1肌醇、2.0mg L-¹P-CPA，0.20mg L^-1TDZ，5mg L^-1AgNO₃，10mg L^-1庆大霉素，100mg L^-1半胱氨酸，50mg L^-1水解酪蛋白、3％葡萄糖和0.28％脱乙酰吉兰糖胶，pH 6.2。将胚性愈伤组织接种到组织分化培养基上进行分化诱导，组织分化培养基为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、150mg L^-1肌醇、1.0mg L^-1P-CPA，0.20mg L^-1TDZ，0.5mg L^-1NOA，0.01mg L^-1GA₃、50mg L^-1水解酪蛋白、2.0mg L^-1甘氨酸、10g L^-1椰乳、5％蔗糖和0.28％脱乙酰吉兰糖胶，pH 6.2。培养条件为温度25℃，湿度70％，光照1000-1500lux，光照时间12小时/天。将分化苗转入生根培养基诱导生根，生根培养基成分为1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.1mg L^-1盐酸硫胺素、0.8mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mgL^-1烟酸、100mg L^-1肌醇、0.5mg L^-1α-萘乙酸钠、0.5mg L^-1NOA、50mg L^-1水解酪蛋白、2.0mg L^-1甘氨酸、3％葡萄糖和0.28％脱乙酰吉兰糖胶，pH 6.2。培养条件为先在光下培养一周，再暗培养一周，再在光下培养至正常生根，温度25℃，湿度70％，光照1500-2000lux，光照时间12小时/天；当苗基部长出3-4条根，根长3cm时打开瓶盖，环境温度25℃，湿度85％，光照强度2000lux，炼苗5天；然后取出组培苗，自来水洗净根部培养基，移栽到灭过菌的珍珠岩基质中，1/8MS营养液浇透后，每周浇灌一次培养液，加盖与营养钵相同大小的上端剪口的塑料袋保持适度，25℃室内培养1个月，后移栽到大田。