[发明专利]一种基于探针熔解技术准确检测BRAF基因突变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于探针熔解技术检测BRAF基因突变的方法。 

背景技术

基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基组成或排列顺序的改变，主要包括碱基的替代和片段的插入缺失，是导致基因型疾病的重要原因之一。基因突变分析在生物医学研究中，尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。BRAF基因编码的蛋白参与由表皮生长因子受体(EGFR)介导的细胞信号转导通路，影响细胞的增殖、生长和转移；正常的BRAF基因编码的蛋白在接受上游信号活化后被激活，并将在信号传递给下游细胞因子后恢复非激活状态；而某些位点(主要在第600位密码子)突变的BRAF基因所编码的蛋白无需上游信号活化便始终处于激活状态，导致细胞的非正常增殖和生长，引起恶性肿瘤。抗EGFR类肿瘤药物通过特异性阻滞EGFR与受体结合，阻断细胞转导通路，从而达到抑制癌细胞增殖的目的；多项研究发现，接受抗EGFR药物治疗的结直肠癌或肺癌患者中，BRAF基因野生型的患者较BRAF基因突变型患者更能从治疗中受益：BRAF基因野生型的患者具有更高的药物客观反应率和较长的生存时间。因此，能够准确检测BRAF突变状态对指导结直肠癌或肺癌患者临床用药有重要意义。 

传统检测BRAF基因突变的方法多种多样，其中最为经典是双脱氧测序技术(Sanger sequencing)，此外还包括连接酶检测反应(LDR)、多聚酶链限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技术。这些方法能够检测突变是否存在，但大多数方法不能确定突变的类型并且只能检测到突变的一部分；同时大多数方法需要琼脂糖凝胶电泳等PCR后处理检测才能分析结果，准确度和灵敏度受限，且假阳性发生率高。近年来，等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR，ARMS)、高分辨溶解曲线(HRM)、变性高效液相色谱分析(dHPLC)和焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)等方法改善了检测的灵敏度和特异性，但仍存在假阳性现象严重、操作繁琐及过度依赖仪器等缺点。 

分子信标探针(Molecular Beacon)是一种可以自发形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针，其常在5’末端标记有荧光基团，在3’末端标记有淬灭基团；当颈环结构形成后，荧光基团和淬灭基团空间距离靠近，发生荧光共振能量转移(FRET)，荧光基团被外界光源激发后发出的光子被淬灭基团吸收，此时探针不能被激发出荧光；若体系中存在与探针序列相匹配的模板，当分子信标探针与模板杂交后，其发夹结构被打开，使得荧光基团与淬灭基团空间距离增大，此时荧光基团被激发出的荧光未被淬灭，可以检测荧光信号；同时由于荧光强度与体系中模板的量呈正比，故分子信标探针可以用于实时定量PCR反应。当分子信标与模板链杂交后，若继续升高温度可导致探针与模板再次分离，从而使得荧光强度随温度升高而降低。将荧光强度对温度变化时间求导数便得到熔解曲线，熔解曲线的峰值为荧光信号降低速率最大时对应的温度，即为模板与探针结合强度(Tm值)。由于序列的差别，探针与野生型模板和突变型模板的结合强度有差别，表现在熔解曲线(熔解峰)的不同。但传统的熔解曲线法灵敏度较低，使得检测结果不准确。 

发明内容

为了克服传统探针熔解曲线法灵敏度低，检测不精确的缺点，本发明提出一种基于探针熔解技术准确检测BRAF基因突变的方法，不仅节省了耗材，同时具有高灵敏度，高特异性的特点，检测结果更可靠。 

为实现以上发明目的，本发明提供如下基本技术方案。 

一种基于探针熔解技术准确检测BRAF基因突变的方法，包括以下步骤： 

(1)分子信标探针和模板扩增引物的设计及合成 

上游引物(27nt)： 

5’-TGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAG-3’ 

延伸阻滞引物(43nt)： 

分子信标探针(35nt)： 

(2)提取被测样本的基因组DNA； 

(3)配制反应体系 

在反应管中加入被测样本的基因组DNA、上游引物、延伸阻滞引物、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、5’→3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM^TM Taq DNA Polymerase)或同类型酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)、分子信标探针、10×PCR Buffer(TIANNIUM^TM Taq PCR Buffer)或同类型Buffer； 

(4)PCR反应