[发明专利]一种基于探针熔解技术准确检测BRAF基因突变的方法

权利要求书

1.一种基于探针熔解技术准确检测BRAF基因突变的方法，包括以下步骤：

（1）分子信标探针和模板扩增引物的设计及合成

上游引物(27nt):

5’-TGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAG-3’

延伸阻滞引物(43nt):

分子信标探针(35nt):

（2）提取被测样本的基因组DNA；

（3）配制反应体系

在反应管中加入被测样本的基因组DNA、上游引物、延伸阻滞引物、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、5’→3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM^TM Taq DNA Polymerase)或同类型酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)、分子信标探针、10×PCR Buffer(TIANNIUM^TM Taq PCR Buffer)或同类型Buffer；

（4）PCR反应

将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增和熔解，PCR反应完成后进行熔解曲线分析，通过熔解峰的Tm值判断出被测样本中是否发生了BRAF突变。

2.根据权利要求1所述的基于探针熔解技术准确检测BRAF基因突变的方法，其特征在于：

以单管反应体系25μl计，反应管中加入上游引物600nM，延伸阻滞引物60nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0.2U，5’→3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM^TM Taq DNA Polymerase)或同类型酶0.5U，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)200μM，dUTP(脱氧尿苷三磷酸)400μM，分子信标探针250nM，10×PCR Buffer(TIANNIUM^TM Taq PCR Buffer)或同类型Buffer2.5μl，ddH2O补足体积25μl。

3.根据权利要求2所述的快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于：

PCR反应参数设置如下：50℃，2～5min；95℃，12～15min；95℃，1～5sec；56℃，0～1sec；65℃，0～1sec；60～70个循环；熔解:95℃，1～5min；50℃→72℃每秒收集荧光15～20次，0.02～0.05℃梯度升温。