[发明专利]星虫重组铁结合蛋白及制备方法

说明书

技术领域

 本发明涉及铁结合蛋白，具体涉及星虫重组铁结合蛋白及星虫的体外重组铁结合蛋白的制备方法。

背景技术

铁结合蛋白（铁蛋白）是一种具有储存数千铁离子及数百磷分子能力的蛋白质，其分子结构被认为是由高度对称性亚基所组合的蛋白质，外壳可以包裹着由铁磷化合物组成的铁核。铁核结构起着供给和存储铁的“仓库作用”，铁蛋白的蛋白壳上含有两种横跨蛋白壳的隧道，即三相(X.Y.Z)物质交换隧道和电子隧道，前者的作用供无机磷铁及其他小分子进出，后者的功能起着接收及传递电子的作用。脊椎动物的铁蛋白由两种不同类型的亚基组成，即H和L亚基，L型亚基与H型亚基相互作用使氧化型铁矿化为一个铁核。。目前大部份是脊椎动物的重组铁蛋白，如申请号为CN为200510048963.X的发明专利申请就公开了利用基因工程技术，通过人乳铁蛋白基因的克隆、重组杆状病毒的构建、家蚕体内表达和人乳铁蛋白纯化得到重组人乳铁蛋白。也有无脊椎动物的重组铁蛋白，如公开号为CN102051363的发明专利申请，则公开了文蛤铁蛋白基因、编码蛋白、体外重组产物等，通过文蛤RNA提取和纯化、cDNA构建及铁蛋白基因的筛选、RACE获得铁蛋白基因序列，再利用铁蛋白基因进行PCR扩增、克隆至表达载体、转化至大肠杆菌、LB培养剂培养、菌体用鸡蛋清溶菌酶处理、超声破碎、从包涵体体中纯化得到目的蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种星虫重组铁结合蛋白及星虫的体外重组铁结合蛋白的制备方法，该重组星虫铁结合蛋白具有存储铁功能外，还具有富集重金属和有机磷的功能。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：星虫重组铁结合蛋白，该星虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

星虫的体外重组铁结合蛋白的制备方法，其步骤如下：

a、 RNA提取：取星虫体壁80-100mg速冻于液氮中，研磨成粉，用RNAiso plus

提取试剂盒提取得到星虫RNA，具体提取方法依照提取试剂盒说明书进行操作； 

b、cDNA合成：将星虫RNA用cDNA试剂盒合成cDNA，具体合成方法依该cDNA试剂盒说明操作，得到cDNA文库质粒，然后用下述引物对合成的cDNA进行PCR扩增，上游引物：5’-TTGTTCTGTC AGGAAGTGGC-3’， 下游引物：5’-CTAACAGGAC TGGTTGACG-3’； PCR扩增体系：cDNA文库质粒：1.0μL，10×PCR 缓冲液：2.5μL，MgCl₂（25mM）：2.0μL，dNTP（10mM）：2.0μL，上游引物（10μM）：1.0μL，下游引物（10μM）：1.0μL，DNA聚合酶（5U/μL）：0.2μL，超纯水：15.3μL，总体积：25.0μL。扩增条件：94℃ 5 min、94℃ 30 s、58℃ 3 s0、72℃ 1min ，共35个循环，最后72℃延伸10 min；扩增反应后，用回收试剂盒回收电泳后的PCR产物，然后PCR产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌E.Coli DH5α后，在含有氨苄浓度为80-100mg/L的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，得到阳性克隆质粒；阳性克隆质粒测序后用BLAST软件进行比对，确定质粒含有星虫铁结合蛋白基因；