[发明专利]星虫重组铁结合蛋白及制备方法

权利要求书

1.星虫重组铁结合蛋白，其特征在于该星虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的星虫重组铁结合蛋白的制备方法，其特征在于步骤如下：

a、 RNA提取：取星虫体壁80-100mg速冻于液氮中，研磨成粉，用RNAiso plus提取试剂盒提取得到星虫RNA，具体提取方法依照提取试剂盒说明书进行操作；

    b、cDNA合成：将星虫RNA用cDNA试剂盒合成cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，得到cDNA文库质粒，然后用下述引物对合成的cDNA进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列为TTGTTCTGTC AGGAAGTGGC， 下游引物的核苷酸序列为CTAACAGGAC TGGTTGACG； PCR扩增体系：cDNA文库质粒1.0μL，10×PCR 缓冲液2.5μL，浓度25mM的 MgCl₂2.0μL，浓度10mM的 dNTP2.0μL，浓度10μM的上游引物1.0μL，浓度10μM的下游引物1.0μL，浓度5U/μL的 DNA聚合酶0.2μL，超纯水：15.3μL；扩增条件：94℃ 5 min、94℃ 30 s、58℃ 3 s0、72℃ 1min ，共35个循环，最后72℃延伸10 min；扩增反应后，用回收试剂盒回收PCR产物，然后PCR产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌E.Coli DH5α后，在含有氨苄浓度为80-100mg/L的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，得到阳性克隆质粒；

c、重组质粒：对上述阳性克隆质粒进行PCR扩增，扩增体系：上述阳性克隆质粒1.0μL，10×PCR 缓冲液2.5μL，浓度25mM 的MgCl₂1.5μL，浓度10mM的 dNTP2.5μL，浓度10μM的正向引物1.0μL，浓度10μM的反向引物1.0μL， 浓度5U/μL的 DNA聚合酶0.2μL，超纯水15.3μL；扩增条件：94℃ 4 min、94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 1min ，共35个循环，最后72℃延伸10 min；其中正向引物的核苷酸序列为GCGGGATCCA TGTCTCTGTC AAGACCA，反向引物序列为GCGAAGCTTG TTTAGCTGTC G CCATCG，扩增产物经QIAquick Gel Extraction纯化试剂盒纯化后，再用BamHⅠ和Hind Ⅲ内切酶酶切，酶切产物与载体pET-28a(+)连接，获得重组质粒，重组质粒转化至E.Coli BL21(DE3)中，再接种到卡那霉素浓度为50μg/mL的 LB培养液中，37℃、120r/min振荡培养至菌液A600值为0.6~0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3-6h，收集菌液经12000r/min离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物，4℃保存；

d、蛋白纯化：细菌沉淀物用1×磷酸缓冲液漂洗，再在4℃、12000 r/min离心5min，得漂洗后细菌沉淀物，每克漂洗后的细菌沉淀物中加入5ml的1×磷酸缓冲液，混匀后4℃下，用450W超声波，超声破碎10min， 12000 r/min离心5min得到包涵体沉淀；每克包涵体沉淀加入200μL 缓冲液B，0.5μLβ-巯基乙醇和4μL浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，在室温放置1h， 12000 r/min离心10min保留上清液，在每毫升上清液中加入镍珠10μL，轻微混匀30min，12000 r/min离心10s，去上清得到镍珠-铁合结蛋白沉淀，10毫克镍珠-铁合结蛋白沉淀中加入250μL缓冲液C和5μL浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，去上清，在2-5毫克沉淀中加入25μL 缓冲液E和5μL浓度为160mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，取上清，得到含重组铁结合蛋白的洗脱液，浓缩洗脱液得到如序列表SEQ ID NO.1所示的星虫重组铁结合蛋白；所述缓冲液B的pH为8.0，所述缓冲液B含有浓度为100mM的 NaH₂PO₄，浓度为10mM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为 6M的盐酸胍；所述缓冲液C的pH为6.3，所述缓冲液C含有浓度为100mM 的NaH₂PO₄，浓度为10mM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为8M的尿素；所述缓冲液E的pH为4.5，所述缓冲液E含有浓度为100mM的 NaH₂PO₄，浓度为10mM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为8M 的尿素。