[发明专利]一种含有pET-28a(+)-protein400重组质粒的大肠杆菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用基因克隆技术得到含创伤弧菌溶细胞素313-445基因突变313位亮氨酸为缬氨酸基因序列细菌菌株，具体涉及一种含有pET-28a(+)-protein400重组质粒的大肠埃希氏菌，序列的表达、纯化、复性的方法及其宫颈癌细胞毒性方面的应用。

背景技术

子宫颈癌在世界各地都有发生，是人体最常见的癌瘤之一，不但在女性生殖器官癌瘤中占首位，而且是女性各种恶性肿瘤中最多见的癌瘤，但其发病率有明显的地区差异。我国宫颈癌的发生，在地理分布上的特点是高发区常连接成片，各省宫颈癌相对高发区的市、县也常有互相连接现象。总的趋势是农村高于城市，山区高于平原。根据29个省、市，自治区回顾调查我国宫颈癌死亡率占总癌症死亡率的第四位，占女性癌的第二位。因此，开发出具有较简短的氨基酸序列与分子质量，更加容易进入宫颈癌细胞发挥作用，致其凋亡的肽尤为重要。

发明内容

本发明的目的之一：提供含有pET-28a(+)-protein400质粒的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WZMC-8326，于2012年12月03日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.6925。

本发明的目的之二：提供一种重组蛋白protein400，其碱基序列如序列表SEQ NO：1所述，氨基酸序列如序列表SEQ NO：2所述。

本发明的目的之三：提供一种重组蛋白protein400的制备方法，包括如下步骤：

本发明提供所述重组蛋白protein400的制备方法，包含以下步骤：

(1)重组载体pET-28a(+)-protein400的构建；

以创伤弧菌标准菌株GTC333全基因组为模板，PCR扩增，利用基因克隆技术定点突变313位亮氨酸为缬氨酸，获得重组蛋白protein400基因。上游引物序列为：5′-CATGCCATGGTGTTTGAAGCGG-3′，下游引物序列为：5′-CCGCTCGAGTGTGGGTTTCCAA-3；并引入Nco I和Xho I酶切点和6×His标签，扩增产物胶回收纯化后与pET-28a(+)载体连接，获得重组克隆载体。protein400基因碱基序列如SEQ NO：1所示。

(2)重组工程菌的制备

重组载体pET-28a(+)-protein400转化入大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)基因组中，得到含protein400基因的重组工程菌。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)WZMC-8326，于2012年12月03日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.6925。

(3)重组蛋白protein400的表达

将重组工程菌接种于LB琼脂平板(含30μg/ml卡那霉素)，于37℃过夜培养；挑取白色单个菌落，接种于LB(含30μg/ml卡那霉素)液体培养基中，37℃、160rpm过夜振荡扩大培养。诱导表达重组蛋白protein400，离心收集菌体破菌，再离心，然后通过Ni²⁺-NTA层析纯化法、稀释透析复性法得到重组蛋白protein400，其氨基酸序列SEQ NO：2。

本发明的目的之四：提供一种重组蛋白protein400应用，其具有宫颈癌细胞的毒性作用。

利用纯化复性的重组蛋白protein400作用于Hela细胞，经流式细胞仪、激光共聚焦等方法检测其细胞毒性作用，具体实验结果见实施例3-4，抗癌效果明显。

本发明的有益效果：

1.pET-28a(+)-protein400重组基因仅为创伤弧菌的一小段序列且其313位氨基酸由原来的亮氨酸突变为缬氨酸，具有较简短的氨基酸序列与分子质量，相对而言更加容易进入细胞发挥作用。

2.成功表达复性的重组蛋白protein400，其氨基酸序列SEQ NO：2，可与细胞膜结合后发挥细胞毒性作用，活性形式为二聚体，且并不具有温度依赖性，相比创伤弧菌溶细胞素形成四聚体后打孔进入细胞并受温度影响而言具有优越性。

附图说明