[发明专利]一种含有pET-28a(+)-protein400重组质粒的大肠杆菌及其制备方法

权利要求书

1.一株含有pET-28a(+)-protein400质粒的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WZMC-8326，已于2012年12月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6925。

2.一种重组蛋白protein400，其特征在于重组蛋白protein400碱基序列如序列表SEQ NO：1，氨基酸序列如SEQNO：2。

3.一种重组蛋白protein400，其特征在于，重组蛋白protein400的制备方法，包括如下步骤：

(1)重组载体pET-28a(+)-protein400的构建

以创伤弧菌标准菌株GTC333全基因组为模板，PCR扩增，利用基因克隆技术定点突变313位亮氨酸为缬氨酸，获得重组蛋白protein400基因。上游引物序列为：5′-CATGCCATGGTGTTTGAAGCGG-3′，下游引物序列为：5′-CCGCTCGAGTGTGGGTTTCCAA-3；并引入NcoI和XhoI酶切点和6×His标签，扩增产物胶回收纯化后与pET-28a(+)载体连接，获得重组克隆载体；protein400基因碱基序列如SEQ NO：1所示。

(2)重组工程菌的制备

重组载体pET-28a(+)-protein400转化入大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)基因组中，得到含protein400基因的重组工程菌，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WZMC-8326，。

(3)重组蛋白protein400的表达

将重组工程菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WZMC-8326接种于LB琼脂平板(含30μg/ml卡那霉素)，于37℃过夜培养；挑取白色单个菌落，接种于LB(含30μg/ml卡那霉素)液体培养基中，37℃、160rpm过夜振荡扩大培养。诱导表达重组蛋白protein400，离心收集菌体破菌，再离心，然后通过Ni²⁺-NTA层析纯化法、稀释透析复性法得到重组蛋白protein400，其氨基酸序列SEQ NO：2。

4.根据权利要求2所述重组蛋白protein400，其特征在于protein400对宫颈癌细胞具有毒性作用。