[发明专利]一种基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的金黄色葡萄球菌无标记电化学适配体传感器

说明书

技术领域

本发明主要利用适配体传感器对金黄色葡萄球菌进行电化学检测，属于电化学领域。特点在于由还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的引入扩大了检测信号，提升检测灵敏度。同时在超灵敏电化学阻抗检测中无需引入标记物，使得检测时间更短，耗费也更少。同时也为金黄色葡萄球菌全菌的检测提供一种新的方法。 

背景技术

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，隶属于葡萄球菌属，是葡萄球均属中最重要的病原菌之一。金黄色葡萄球菌是一种强致病菌，侵袭人体后可引起化脓性感染，并且还可以通过分泌肠毒素造成急性肠炎，表现为呕吐、腹泻等。由于金黄色葡萄球可在有氧或无氧的环境中生长、高度耐盐、并且对温度(7～38.5℃最适温度37℃)和PH(4.2～9.3最适PH为7.4)的要求很低，因此它能广泛存在于食品当中，造成严重的食品安全问题。另外金黄色葡萄球菌也是人和动物化脓性感染最常见的病原菌，由于近年来抗生素的广泛使用，导致耐药性菌株迅速增多，金黄色葡萄球菌也成为医院感染最常见的致病菌，因此金黄色葡萄球菌也被列为仅次于大肠杆菌的重要病原菌，金黄色葡萄球菌污染也属于世界性的卫生问题。 

传统的金黄色葡萄球菌检测方法用国标法，这是我国规定的食品中金黄色葡萄球菌的标准检测方法，其原理主要基于细菌的培养分离，通过接种、预增菌、平板划线培养、然后对平板上的可见菌落进行计数。此法不仅耗时(3～6天)灵敏度也很低，很难满足现今快速评价食品中微生物安全性的要求。为此迫切需要扩展金黄色葡萄球菌的检测，尤其是建立更加灵敏快速的检测方法。近年来金黄色葡萄球菌的快速检测工作不断取得进展，基于抗原抗体的免疫学方法酶联免疫技术(ELISA)、PCR、环介导等温扩增技术等都可以实现对金黄色葡萄球菌的快速检测，但是这些方法检测的目标物质多为金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素或者某一段基因片段等，直接针对整体菌的检测方法相对较少。 

适配体传感器由于其快速、高灵敏、高特异性和造价低廉等优点在生物诊断、环境监测和食品安全方面发挥着越来越重要的作用。核酸适配体是经指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选出来的能够特异性结合蛋白质、核酸、金属离子等小分子物质和病原菌等生物大分子的一段单链DNA或者RNA片段。由于适配体可以1)与目标物质的特异性结合具有高度亲和力和严格识别性；2)能够在体外合成，并且能在不影响其生物活性的基础上根据需要修饰不同的功能集团。并且适配体可反复变性复性、易于保存、造价低廉，这些优点确保适配体用于生物传感器相比于传统纳米材料具有更高的灵敏度和更短的耗时。 

发明内容

本发明通过引入金黄色葡萄球菌全菌适配体捕获探针，利用超灵敏电化学阻抗技术，根据适配体结合金黄色葡萄球菌前后阻抗值得变化实现定量检测。同时引入了ssDNA连接的还原氧化石墨烯-纳米金复合纳米材料，提高电子传输和比表面积，扩大检测信号，提升了检测的灵敏度。本发明所构建的适配体传感器特异性高，灵敏度好、耗时短、造价低廉。当捕获探针结合有金黄色葡萄球菌有，会降低电极表面电子传输，响应电流也随之减弱，电化学阻抗值下降。以此现象对金黄色葡萄球菌标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含有金黄色葡萄球菌样品进行定量检测的目的。 

为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案： 

(1)裸电极依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末在麂皮上各打磨8min，每次换不同粒径氧化铝粉末前都用超纯水将麂皮和电极上的残余粉浆冲洗干净。然后分别用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声5min，电极用氮气极吹干备用。 

(2)裸玻碳电极的测试：称取3.73gKCl及0.082gK₃Fe(CN)₆溶于50mL容量瓶中，配成5mMFe(CN)₆^3-和1mol/L KCl溶液；打磨清洗好的电极为工作电极，银/氯化银为参比电极，铂丝为对电极组成三电极体系进行循环伏安测试，工作电压为-0.2～0.6V，扫速为100mV/s，直到得到峰形稳定、形状良好、峰与峰差值小于65mV的循环伏安图。 

(3)合成巯基化金黄色葡萄球菌适配体：序列为：5′-HS-(CH₂)₆-GCA ATG GTA CGG TAC TTC CTC GGC ACG TTC TCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AAA GTG CAC GCT ACT TTG CTA A-3`(上海生工生物工程股份有限公司完成)。