[发明专利]一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法，尤其涉及一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。

背景技术

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14-17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强，即便在PH3的酸性环境及72℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒。

PCV-2是断乳仔猪多系统综合征(Post-weaning multi-systemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。自1991年PMWS在北美最先发现以来，已在世界范围内流行。由于PCV-2经常与多种病原混合感染，典型性临床症状有消瘦、皮肤苍白、腹泻、呼吸障碍及轻度的黄疸，还包括神经症状、繁殖障碍、皮炎等。PCV-2及其相关的猪病死亡率10%~30%不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。目前还没有治疗这种疾病的方法，现有预防和控制猪圆环病毒病最为有效的方法就是接种疫苗。

目前，猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式，进而增殖猪圆环病毒。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢。而且生产过程中对细胞和病毒的培养条件，如PH、溶氧、糖耗等难以监控和适时补给，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致生产的产品质量稳定性不够，批间差较大。另外由于该病毒是一种DNA病毒，病毒变异率低，同时在世界范围内的致病只有PCV2一型。而PCV2的生物学特殊性比较特殊，它在细胞上的增殖滴度很低，而且不引起细胞病变，因此产毒滴度较低也是一个更为重要的问题，并且与当前大规模动物疫苗生产不相适应。此外如要扩大生产规模只能通过增加转瓶数量的方法，结果导致车间规模、设备通入、人员等需求更大，劳动量更大。

综上所述，本领域还需继续研发一种适用的制备猪圆环病毒疫苗的新方法。另外提高病毒毒价，保证良好的临床效果是解决猪圆环病毒2型灭活疫苗产业化的当务之急。

发明内容

本发明的目的为提供生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低，操作工艺程序不繁琐，批间差异小，产品质量高且稳定的一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。

为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

该利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，所述的生物反应器为激流式生物反应器，通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤：

1）在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为2-5×10⁹个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.2-7.4、温度36.8-37.5℃及溶氧DO60%-90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min、振荡器转速50-60rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；

2）加入病毒维持液，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为生物反应器工作体积的5%，在培养条件为pH值7.4-7.6、温度36.5-37℃及溶氧DO60-90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min和振荡器转速50-60rpm培养猪圆环病毒2型；

3）培养猪圆环病毒2型72-120h后，每隔6-12h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15℃以下冷冻保存；

4）制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。

进一步，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。

进一步，所述的纸片载体密度为15-20g/L。

进一步，所述的细胞生长液为含体积浓度为8-10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基，病毒维持液为含体积浓度为1-2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。