[发明专利]一种检测过敏原牛奶的试剂盒和引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测过敏原牛奶的试剂盒和引物，属生物技术领域。

背景技术

食物过敏已成为重要的食品安全问题。过敏性疾病发病率呈逐年上升趋势。据文献报道40%的小孩被诊断出在某种程度上患有过敏性疾病，1990～2000年在英国和爱尔兰已有8人死于此病。食物过敏目前只能预防，不可治愈。为了维护易过敏消费者的利益，美国和欧盟制定了食品致敏原标签法规，法规要求生产企业明确标明其产品中是否含有8大类和12种主要的食品致敏原，乳及乳制品是FAO/WHO认定的导致人类食物过敏的八大类食品之一,作为婴儿和儿童的主要食品及成人餐饮主要构成部分的牛奶与奶制品的质量和安全备受关注。由于婴儿和儿童的耐受力有限，过敏一旦发生结果往往比较严重。甚至会导致儿童过敏性死亡,调查发现牛奶及其制品引发的儿童过敏发生率高达7.5％，因此牛奶也是美国及欧盟新食品标签法中规定必须标示的过敏原成分之一，而中国食品出口企业常因食品过敏原标注不正确而被美国FDA通报且遭遇退货。国内的过敏原研究尚处在起步阶段。本研究尝试在国内研制出高灵敏、高特异的牛奶过敏原成分lamp检测试剂盒．以满足我国进出口食品贸易的需求．同时为制定我国食品过敏原标签管理奠定了技术基础

目前普遍应用基于DNA的检测技术对过敏原牛奶进行检测。用于检测牛乳过敏原的方法有多种：免疫吸附实验(ra—dio—allergosorbent test，RAST)、高压液相层析法(high—pressure liquid chromatography，HPLC)、SDS—PAGE电泳、酶联免疫吸附实验(enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA)等：但是加工对牛乳中过敏原成分会产生一定的影响，比如一些热处理，会对牛奶的过敏原成分，主要是一些蛋白类物质产生影响，从而影响检测，而且，这些方法需要对操作技术有一定的要求，检测周期长。而环介导的等温扩增技术Loop-MediatedIsothermal Amplification，LAMP)依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列，因此不需要PCR仪。由此建立基于LAMP扩增技术的过敏原牛奶检测方法并开发了相应的检测试剂盒，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测过敏原牛奶的LAMP引物。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的检测过敏原牛奶的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一组检测过敏原牛奶的引物，该组引物是依据NCBI收录号NC_006853.1对应的基因序列设计的，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.5所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ ID No.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ IDNo.5为环状下游引物。详见表1。

表1引物序列

本发明所提供的引物具有以下优点：(1)高效灵敏。近年来的研究显示引入环状引物将有助于提高检测灵敏度，缩短反应时间。(2)特异性强。

本发明提供一种检测过敏原牛奶的试剂盒，包括以下试剂：

（1）LAMP反应液，其包括：ThermoPol缓冲液、甜菜碱、dNTPs、MgSO₄、外侧上游引物（F3）、外侧下游引物（B3）、内侧上游引物（FIP）、内侧下游引物（BIP）、环状下游引物（LB）；

其中，外侧上游引物（F3）是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，外侧下游引物（B3）是序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，内侧上游引物（FIP）是序列表SEQID No.3所示的核苷酸序列，内侧下游引物（BIP）是序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，环状下游引物（LB）是序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；引物委托大连宝生物工程有限公司合成；

（2）Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司；

（3）DEPC水；

（4）阴性对照：DEPC水；

（5）阳性对照：由市售欧德堡超高温处理全脂纯牛奶（德国）提取的核酸作为阳性对照；

（6）显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司。