[发明专利]Harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，涉及Harpin编码基因hrpZ_PsgS1或其表达的harpinZ_PsgS1蛋白的应用。

背景技术

大豆细菌性斑点病是我国尤为北方大豆产区的一种主要病害，给农业生产带来巨大损失，其致病菌丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea）也是世界范围内重要的植物病原细菌。同其他革兰氏阴性植物病原细菌一样，Pseudomonas syringae pv. glycinea 拥有保守的hrp基因簇，决定着病原菌在非寄主植物和抗病植物上的过敏反应（hypersensitive response, HR）和在感病寄主上致病性（pathogenicity）。hrp基因簇的特定基因编码产物harpins是一类非特异性蛋白质激发子，该蛋白质富含甘氨酸，不含半胱氨酸，对热稳定，对蛋白酶K敏感，可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应，并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制，是目前研究得较为深入的一类细菌分泌蛋白。Wei（1992）首次从梨火疫（E. amylovora）中分离得到一种能引起过敏反应的蛋白激发子HrpN，随后harpin在所有常见的革兰氏阴性植物病原细菌中得到了鉴定。

       国外已从P. syringae 5个致病变种中克隆出相应的hrp基因，并证实其活性，但国内对来源于丁香假单胞菌（P. syringae）的hrp 基因方面的研究较少，不同菌株编码的harpin蛋白的活性和功能也不尽相同，并且体外高效表达纯化的harpin蛋白用于指导生物防治还没有得到广泛的应用。 因此，harpin蛋白作为新型微生物蛋白农药的代表具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的harpin编码基因hrpZ_PsgS1或其表达的harpinZ_PsgS1蛋白的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

    harpin编码基因hrpZ_PsgS1或其表达的harpinZ_PsgS1蛋白在促进烟草的生长，提高烟草抗病性中的应用，其中，所述的harpin编码基因hrpZ_PsgS1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，harpinZ_PsgS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述的harpin编码基因hrpZ_PsgS1或其表达的harpinZ_PsgS1蛋白优选在促进烟草的生长，有效提高烟草对烟草花叶病毒病和烟草疫霉病的抗性中的应用。

其中，所述的harpinZ_PsgS1蛋白优选通过如下方法制备：

（1）提取大豆细菌性斑点病菌S1菌株的基因组DNA，根据Genbank中登录号为L41862的hrpZ序列，设计完整开放阅读框引物hrpZ_PsgS1-P1: SEQ ID No.3/ hrpZ_PsgS1-P2: SEQ ID No.4;

（2）将-70℃保藏的保藏号为CGMCC No.6699的大豆细菌性斑点病菌S1菌株在KB固体培养基上28℃条件下培养24小时后转入KB液体培养基，继续震荡培养24h后，收集新鲜的菌液提取基因组DNA，以活化的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，循环35次，72℃延伸10min;

（3）将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经质粒PCR和酶切验证得到阳性转化子,提取重组质粒DNA并测序;