[发明专利]Harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白的应用

权利要求书

1.harpin编码基因hrpZ_PsgS1或其表达的harpinZ_PsgS1蛋白在促进烟草的生长，提高烟草抗病性中的应用，其中，所述的harpin编码基因hrpZ_PsgS1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，harpinZ_PsgS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于harpin编码基因hrpZ_PsgS1或其表达的harpinZ_PsgS1蛋白在促进烟草的生长，有效提高烟草对烟草花叶病毒病和烟草疫霉病的抗性中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的harpinZ_PsgS1蛋白通过如下方法制备：

（1）根据Genbank中登录号为L41862的hrpZ序列，设计完整开放阅读框引物hrpZ_PsgS1-P1: SEQ ID No.3/ hrpZ_PsgS1-P2: SEQ ID No.4;

（2）将-70℃保藏的保藏号为CGMCC No.6699的大豆细菌性斑点病菌S1菌株在KB固体培养基上28℃条件下培养24小时后转入KB液体培养基，继续震荡培养24h后，收集新鲜的菌液提取基因组DNA，以活化的基因组DNA为模板，以hrpZ_PsgS1-P1: SEQ ID No.3/ hrpZ_PsgS1-P2: SEQ ID No.4为引物进行PCR扩增反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，循环35次，72℃延伸10min;

（3）将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经质粒PCR和酶切验证得到阳性转化子,提取重组质粒DNA并测序;

（4）以测序正确的阳性重组质粒pMD18-T-hrpZ_PsgS1为模板，PCR扩增,扩增产物回收后经BamH1和EcoR1双酶切后连接到表达载体pET41a(+)上，使得hrpZ_PsgS1基因与pET41a(+)上的还原型谷胱甘肽GST标签融合，进而得到重组质粒pET41a(+)-hrpZ_PsgS1,将重组质粒和pET41a(+)转入大肠杆菌BL21后经质粒PCR和酶切鉴定出阳性重组菌株;

（5）重组菌株BL21/pET41a(+)-hrpZ_PsgS1在含km50μg /ml 的LB液体培养基中，37℃、200rpm/min 振荡培养过夜，次日按照1%的比例转接到km50的液体LB中，37℃振荡培养约2-3h，至OD₆₀₀=0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃振荡培养2-3h，取诱导的菌液离心收集菌体， 用PH7.4的终浓度为0.1M的PBS润洗三次菌体，重溶于1/20原菌体培养体积的PBS中，向菌体悬浮液中加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶，终浓度为0.1mM的蛋白酶抑制剂PMSF，经超声波破碎后离心取上清即为粗提蛋白，使用GSTrap FF对标签蛋白进行纯化，具体操作参照说明书进行，得到纯化的harpinZ_PsgS1蛋白。