[发明专利]非洲爪蛙增殖诱导配体TNFSF13基因和蛋白质制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA及其克隆、表达技术。

背景技术

鉴于肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员具有促进细胞生长、分化或死亡的功能，在淋巴器官的形成，免疫细胞的激活及维持机体的稳态等方面都发挥重要的生物学作用，所以近年来，越来越多的TNFSF家族成员被发现。增殖诱导配体(APRIL)为肿瘤坏死因子超家族的一名新成员,即TNFSF13，又名CD256，TALL-2，TRDL-1，与BlyS即TALL-1具有较高的同源性，1998年首先由Hahne等发现并成功克隆。APRIL表达于树突状细胞、巨噬细胞和T、B淋巴细胞表面，除此之外还在多种肿瘤细胞系和肿瘤组织中有高水平表达，暗示了APRIL有着不同于家族中其他成员的重要功能。研究证实APRIL参与B淋巴细胞的成熟和活化，调节Ig类型转换，与免疫系统的调节关系密切，在多种肿瘤细胞的增殖、存活及抗肿瘤研究过程中具有独特作用。APRIL与BlyS一样能与TACI和BCMA结合，在小鼠体内注射大量重组APRIL可导致B细胞在脾中积聚而引起脾的重量的增加，说明APRIL对B细胞也具有促存活、增值的作用，但是只是起了一个协同刺激作用,用可溶性TACI-Fc和BCMA-Fc都可以阻断。除此之外有研究表明APRIL是一有效的T细胞体外刺激因子，促进T细胞的增殖，还可能是通过上调Bcl-2明显延长T细胞的存活时间，进而影响T淋巴细胞介导的免疫反应。总之，APRIL在T、B淋巴细胞的成熟活化中起到重要的作用，因而与T、B细胞介导的免疫系统调节关系密切。

爪蛙，又名非洲爪蛙，负子蟾科，无尾目，脊索动物门。19世纪末就开始对爪蛙的研究，至今已成为胚胎学、发育生物学、细胞生物学、功能基因组学等研究的重要模式生物，在疾病动物模型、药物筛选及疾病治疗领域都有相应的研究也取得一定的进展。非洲爪蛙每年作为实验室动物的使用数量高达数万只，并且近年来作为宠物也被广泛饲养，提高其免疫能力对于爪蛙的养殖及其后期的实验研究都具有重要的意义。除此之外，两栖类动物如具有较高经济价值的牛蛙，APRIL蛋白可以作为两栖类动物的免疫增强剂，增强其抗微生物和病毒感染的能力。

根据Genebank、EMBL、DDBJ国际三大主要核酸序列数据库的搜索结果得知，到目前为止人、鼠、猪、狗、牛、羊、鲑鱼、斑马鱼等APRIL的cDNA已被克隆，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，而至今模式生物中作为两栖类代表的非洲爪蛙APRIL（XlAPRIL）的cDNA还未被克隆出来，关于非洲爪蛙APRIL基因的研究在整个国内外还处于完全空白状态。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量的细胞因子得以克隆及重组表达，许多细胞因子基因工程药物面市，给治疗疾病提供了新的手段，同时创造了巨大的经济和社会效益，因此，重组XlAPRIL蛋白具有潜在的巨大市场应用价值。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种从非洲爪蛙中提取增殖诱导配体cDNA，并提供非洲爪蛙增殖诱导配体cDNA的克隆方法及重组技术。

本发明从非洲爪蛙中克隆到增殖诱导配体cDNA，它的序列如SEQ ID NO.1所示。

非洲爪蛙B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA的克隆方法如下：

(1)提取非洲爪蛙脾脏组织总RNA，SMARTTM RACE试剂盒(TaKaRa)逆转录为cDNA第一链；

(2)设计引物扩增该基因的中间片段：

正义寡核苷酸引物：Xl-F：5’-CTCTGGGGGGGTACAGGA-3’(SEQ ID NO.6)

反义寡核苷酸引物：Xl-R：5’-TTAAAGCCTGACAAGACCAAG-3’(SEQ ID NO.7)

(3)根据中间片段序列设计引物扩增该基因的3’端：

3’端正义寡核苷酸外引物：GSP-3F1’：5’-TTCACGATGGGACACTTGATAACACGT-3’(SEQ ID NO.8)

3’端正义寡核苷酸内引物：GSP-3F2’：5’-AGAGCWTGGCGTATAACACCTGTTACA-3’(SEQ ID NO.9)

3’端反义寡核苷酸外引物：

UPM：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(SEQ ID NO.10)

3’端反义寡核苷酸内引物：