[发明专利]利用高通量组织芯片检测GOLPH3在脑胶质瘤中的表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测GOLPH3在脑胶质瘤中的表达领域，特别涉及一种利用高通量组织芯片检测GOLPH3在脑胶质瘤中的表达的方法。 

背景技术

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是人类星形胶质细胞瘤中恶性程度最高、最顽固的肿瘤，大多数病人的生存期低于2年。其快速浸润性生长使得大多数肿瘤在诊断时已无法完全切除。治疗方案包括外科手术、放射治疗和辅助性化疗。手术切除是治疗过程中非常重要的一个部分，可以达到明确诊断、缩小肿瘤体积、减少细胞数目并提高患者生存期的目的。然而，尽管经过目前最有效的治疗，GBM患者在明确诊断后的预后生存期仍只有14个月。为了达到早期诊断和更好的疗效，已经付出了许多努力来寻找新的分子标记物和靶向疗法。在GBM基因和分子异常方面的最新发现使得治疗方向分子靶向药物和更多合理的靶向分子治疗转移。几个新的基因，如EGFR、RDA51、SOX2和VEGF，被发现参与了GBM的肿瘤形成和进展过程。新的抗上述靶点的治疗药物（如贝伐单抗）已在临床试验中深度研究。最近FDA已批准了贝伐单抗用于复发胶质瘤的治疗。 

高尔基磷酸化蛋白3（GOLPH3），也称为GPP34/GMx33/MIDAS，是一种具有34kDa分子重量的高度保守的蛋白质。它被发现横穿在从酵母菌到人类的全部真核生物系中。这个蛋白质位于反面高尔基网，由人类染色体5p13的一个基因编码。GOLPH3参与了蛋白质的运输、受体的循环和从高尔基体到质粒膜的糖基化过程。最新的研究发现GOLPH3可以促进细胞性状转化和肿瘤生长。尤其是，GOLPH3在多种实体肿瘤中都高表达，包括黑色素瘤、结肠腺癌和非小细胞肺癌。GOLPH3提高了人类癌细胞中雷帕霉素（mTOR）信号对哺乳动物的靶向性，并调节了分子对mTOR抑制剂的反应。mTOR，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是雷帕霉素的靶向，作为蛋白质合成和细胞生长的初级调控者，是受体酪氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3激酶通路（RTK-PI3K）的关键整合分子，而RTK-PI3K通路则是GBM超激活通路中最常见的一条。 

在一项对76例胶质瘤患者的研究中，Li等人发现在高级别胶质瘤中GOLPH3表达更高。理解GOLPH3是如何失调的以及异常表达的GOLPH3对GBM的肿瘤发生和药物反应有何作用可有助于发现新的预后标记物和新的介入治疗途径。 

组织芯片(TMA)技术的发展，得益于生物芯片技术等的延伸。TMA具有高通量、快速、低误差、用途广泛等特点，目前主要应用在肿瘤病理学、实验室检测、药物研究等。利用组织芯片技术可以在细胞水平定位和蛋白水平检测相应靶标，从而实现基因及其表达产物与组 织形态学研究以及临床数据相结合，同时还可以与原位杂交技术等相结合，因此TMA被广泛应用在肿瘤病理研究中,例如EMSY通路在乳癌及卵巢癌中的关系，AlphaB-Crystallin与乳癌的关系，TMPRSS2和ETS转移因子在前列腺癌的重要作用等。 

TMA常见类型有演化TMA、预后TMA等。演化TMA指将某一肿瘤疾病发展的各个阶段的标本（诸如原发间变和继发胶母、原发胶母和复发胶母等）集中在一块TMA中，能在一张切片上同时看到肿瘤组织在原位、转移、复发等不同进展阶段的变化情况，可用以检测特定肿瘤在不同发展阶段的分子病理改变，有助于对肿瘤发生、发展及浸润转移等过程的研究。预后TMA是将带有可利用的临床随访数据的肿瘤标本集中在一张TMA中。使用预后TMA可以研究已知的分子靶标的改变或信号传导通路的变化对肿瘤患者预后的影响^[2]。TMA阵列中每个组织片段都对应于相应患者，因此利用TMA，结合临床数据和随访资料，可以对肿瘤患者进行大规模的回顾性数据分析，为疾病的早期诊断、早期治疗等提供指导。文献报道利用预后TMA发现Cyclooxygenase-2对鼻咽癌患者放疗预后有预测价值。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用高通量组织芯片检测GOLPH3在脑胶质瘤中的表达的方法，该方法使得检测GOLPH3的表达的灵敏性大大提高，能保证在极少的标本中获得足够的信息；检测GOLPH3的表达具有重要的医学价值。 

本发明的一种利用高通量组织芯片检测GOLPH3在脑胶质瘤中的表达的方法，包括： 

（1）首先构建人胶质瘤细胞的组织芯片，然后进行免疫组化染色； 

（2）培养人胶质瘤细胞； 

（3）在GOLPH3的cDNA序列中采用下列两条候选序列对GOLPH3进行siRNA的敲减：