[发明专利]含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于RNA干扰技术治疗领域，涉及siRNA及其制备方法和应用，具体涉及含自由三磷酸基团的特异性siRNA靶向肿瘤代谢关键酶GLS，及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

肿瘤细胞不受限制的生长增殖依赖于其快速的能量供应和胞内氧化还原平衡系统，有氧糖酵解（Glycolysis，也称Warburg effect）和谷氨酰胺酵解（Glutaminolysis）是肿瘤细胞满足上述要求的两个关键步骤。通过有氧糖酵解途径，肿瘤细胞将大部分的葡萄糖（Glucose）催化水解产生乳酸，快速产生ATP等高能分子；同时由于进入三羧酸循环（TCA cycle）的丙酮酸减少（Matthew G et al. Science. 2009），肿瘤细胞通过高表达谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS）来催化谷氨酰胺产生谷氨酸，谷氨酸进一步水解产生a-酮戊二酸进入三羧酸循环，以补充因有氧糖酵解而减少的TCA循环生物总量，并且通过这个替代途径为肿瘤细胞快速的分裂增殖补充能量、碳骨架、核酸和脂质合成的中间产物等。此外，谷氨酰胺酵解还提供细胞抗氧化系统中最为关键的分子——谷胱甘肽（Glutathione，GSH），能够有效清除肿瘤细胞旺盛代谢所产生的氧自由基等活性氧（ROS），维持细胞内的氧化还原平衡（Erickson JW and Cerione RA. Oncotarget. 2010）。综上，谷氨酰胺酵解途径对于肿瘤细胞的生长增殖至关重要，因而使GLS成为一个抗肿瘤的潜在靶点。

科学家已经发现一些GLS的化学抑制剂，但治疗效果均不甚理想，可能与肿瘤细胞产生的耐药性、药物靶向特异性不足及毒副作用有关。小干扰RNA技术直接沉默目的基因是目前最有效而且最特异的手段。这种含21-23个碱基对的特异双链RNA序列，其反义链能靶向识别这些分子相应的信使RNA（mRNA），并在相关酶的协同作用下，剪切mRNA从而干预目的蛋白的合成。但在抗肿瘤领域，小干扰RNA的靶向的特异性决定了其作用机制的单一性，从而使其抗肿瘤治疗效果并不理想。

发明内容

发明人通过大量实验设计并筛选出多条具有良好基因沉默功能的人GLS特异性siRNA，通过设计5’→3’端依次含有GLS特异性siRNA的cDNA序列、胞嘧啶核苷及T7RNA聚合酶启动子序列的DNA模板，在体外利用T7RNA聚合酶转录合成得到含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA（以下简称ppp-GLS），其特征为5’端为一鸟嘌呤核苷，在该鸟嘌呤核苷的戊糖5’位点上修饰有一个自由三磷酸基团。

该ppp-GLS的显著性效果表现为：

（1）本发明ppp-GLS能有效地特异性沉默肿瘤代谢关键酶——谷氨酰胺酶（GLS）蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的代谢过程，显著降低肿瘤细胞内ATP水平，从而有效地抑制肿瘤细胞生长增殖。

（2）本发明ppp-GLS，一方面由于含自由三磷酸基团的siRNA能够上调胞内ROS的产生；另一方面，通过沉默GLS显著性地抑制胞内关键的抗氧化分子谷胱甘肽，破坏肿瘤细胞对ROS的清除作用，从而能够协同作用，使肿瘤细胞内的ROS大量累积，诱发肿瘤细胞死亡。

（3）本发明ppp-GLS为5’端含自由三磷酸基团的siRNA，是胞浆内视磺酸诱导基因-I（RIG-I）的特异性配体，能激活固有免疫信号通路，并分泌多种细胞因子，活化机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用；同时能够大幅度上调肿瘤细胞表面I类抗原递呈分子的表达，阻断肿瘤免疫逃逸。

（4）本发明ppp-GLS能激活肿瘤细胞内源性凋亡通路，大幅度上调Noxa、Caspase，PARP等前凋亡蛋白和凋亡蛋白的表达，诱导肿瘤细胞的程序性死亡。

本发明的特色是将上述4种独特的抗肿瘤功能融合于一个分子。对比于传统的小干扰RNA（OH-RNA，一种直接体外化学合成的siRNA，其5’端核苷C-5上仅含有一个自由羟基，而不含有磷酸分子）、非特异性的含自由三磷酸基团的siRNA（简称ppp-RNA）和其它靶向GLS的化学药物有着更加显著的优势：更有效地促进了肿瘤细胞的死亡和抑制肿瘤生长；该药物并不存在肿瘤细胞产生耐药性的问题（如对化疗药物的耐药）；更重要的是，该药物对正常细胞并无毒性作用。