[发明专利]一种可高通量检测东海原甲藻自然水样的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物技术领域，尤其涉及的是一种可高通量检测东海原甲藻自然水样的试剂盒。

背景技术

赤潮是指由于海洋浮游生物，包括藻类（主要原因种）、原生动物和细菌的过度繁殖或聚集造成海水变色的现象。近年来，由于人类活动的加剧，海洋日趋富营养化，导致赤潮频发，并已成为一种全球性的生态灾害，给水产养殖业、捕捞业和滨海旅游业造成了巨大损失，同时也给海洋生态环境带来负面影响，甚至直接威胁人类健康。

对赤潮原因种（包括东海原甲藻）进行正确鉴定是研究、认识和防治其引起的赤潮的前提和基础，同时更应建立简单、快速和特异性强的检测方法，监测赤潮高发区的水环境，对可能爆发的有害赤潮进行预警，特别是指导渔业生产者及时采取应对措施，以减少经济损失。因此，赤潮藻检测方法成为近年来的研究热点。

当前，对自然水样中的赤潮藻（包括东海原甲藻）的检测的传统方法，主要是以其分类学特征为基础，借助光镜和电镜对其细胞形态特征进行观察，并最终对其进行鉴定。

最近，分子生物学技术为赤潮藻的鉴定提供了新思路。赤潮藻的分子检测技术以藻细胞的基因组核糖体DNA（rDNA）为靶目标，其主要原因是藻类基因相对恒定，不会随其表观形态特征随环境条件的不同而发生变化。因此，其可克服形态学鉴定法的缺点，具有特异性强，检测迅速的特点。近年来，出现了大量有关赤潮藻分子检测方法，包括：DNA测序、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）(random amplified polymorphic DNA)、全细胞荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）、实时荧光定量PCR和三明治杂交（sandwich hybridization, SHA）等。而建立的东海原甲藻的分子检测技术主要包括：基于核酸荧光探针和荧光抗体探针的FISH、实进定量PCR及SHA等。

可见，当前还没有一项高通量检测赤潮藻水样的技术及其相应的试剂盒的报道。

发明内容

本发明是提供一种能高通量检测东海原甲藻自然水样的便携式试剂盒，该检测试剂盒主要是基于核酸序列扩增及RNA斑点杂交技术原理制成。

本发明的技术方案如下：

一种可高通量检测东海原甲藻自然水样的试剂盒，其组成为：

（1） 试剂A为自然样品核酸粗提试剂，其组成为：2% (m/v)CTAB, 0.5%(v/v) β-mercaptoethanol, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, 10 U RNase Inhibitor；

（2）试剂B为5×NASBA Buffer，其组成为0.2 M Tris-HCl, 60 mM MgCl₂, 0.35 M KCl₂, 25 mM DTT,  20 mM dNTP；

（3）试剂C为NTP（10 mM each)；

（4）试剂D为5×Primer mix，其组成为：75% DMSO, 1 μM NASBA-P1, 1 μM NASBA-P2, 25 mM DTT,  20 mM dNTP；

（5）试剂E为4×Enzyme mix，其组成为：1.5 M山梨醇, 0.42 mg/ml BSA, 16 U /ml RNase H, 6400 U/ml T7 RNA Polymerase, 1280 U/ml RT-M-MLV, 4000 U/ml RNA inhibitor；

（6）试剂F为RNA变性剂，其组成为：1.5 M NaCl，0.15 M二水柠檬酸三钠，pH 7.0, 0.15 M 甲醛；

（7）试剂G为杂交液，其组成为1% Blocking Reagent II，0.75 M NaCl, 0.075二水柠檬酸三钠，50 μg/ml 鲑精DNA；

（8）试剂H为地高辛标（DIG）标记探针，2 ng/μl，探针序列： 5’-GCACGGCATACCTTCTAAGAG-3’；

（9）试剂I为Buffer II，其组成为：1% Blocking Reagent II, 0.1 M Tris, 0.15 NaCl, pH 7.5；

（10）试剂J为碱性磷酸酶标记的DIG抗体(AP-抗DIG)；