[发明专利]应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检验技术领域，具体是一种应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒（Hog cholera lapinized virus，HCLV）疫苗株进行定量检测的方法。

背景技术

1猪瘟病毒（CSFV）的实验室检验技术

国内对CSFV的传统诊断方法包括:免疫荧光试验、细胞分离培养试验、动物接种试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、血清学方法等。这些方法都存在自身明显的不足之处，很难对猪瘟病毒进行快速、灵敏的检测。

2猪瘟病毒的疫苗生产过程中所用检验方法现况

疫苗效价的高低是疫苗合格与否的关键指标，对HCLV疫苗的效价测定一直沿用兔体定型热反应法（兔热法）。但该法存在的突出不足是：不能准确定量；测毒结果易受兔体个体差异和天气条件影响；实验周期长、费时费力。由于不能准确的定量病毒，所以不能准确科学的进行疫苗成品的配制，结果就是疫苗产品质量不稳定，有效病毒含量高的批次浪费抗原，有效病毒含量低的批次起不到良好的疫苗保护效果。

发明内容

为了实现对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行快速准确的定量检测，本发明提供了应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法。

本发明提供的应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法，采用Taqman探针法实时荧光定量PCR进行定量检测，上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示，Taqman荧光探针序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，Taqman荧光探针序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记为TAMRA。

所述方法可以包括以下步骤：

（1）提取待测样品的RNA核酸；

（2）配置定量PCR反应液；

（3）将待测样品的核酸加入步骤(2)配置的反应液中，制得到反应体系；

（4）配制标准品PCR反应液，将标准品按梯度稀释，每个稀释梯度液取液加入步骤(2)配置的反应液中，制得反应体系；

（5）将配置的反应液置于定量PCR仪中，运行定量PCR检测反应程序；

（6）扩增反应结束后，结合PCR所给出标准曲线计算待测样品中RNA模板拷贝数，并由此计算待测样品中猪瘟病毒具体含量。

下面是各步骤可以分别或者结合采用的具体操作方法。

步骤（1）按照常规TRIZol试剂法提取待测样品的RNA核酸。

步骤（3）和（4）所述的反应体系包括：PCR MIX12.5μL，10μm/L的上游引物0.5μL，10μm/L的下游引物0.5μL，样品的核酸1μL，超纯水10.5μL。

步骤（4）的标准品为RNA片段，序列如SEQ ID NO：4所示。

步骤（4）将标准品按10倍的梯度稀释，依次含有标准品RNA拷贝数为10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³。

步骤（5）所述的定量PCR检测反应程序包括：42℃反转录30min，95℃预变性3min；94℃变性10s，65℃退火及延伸15s，45个循环。

与现有支原体检测方法相比，本发明主要优点在于：

（1）特异性高：一对引物对猪瘟病毒基因组特异性区域的识别保证PCR扩增的高度特异性。

（2）检测周期短：PCR检测方法可以4个小时得出结果，而传统兔热方法检测周期要120小时。

（3）稳定性高：同一样品的不同检测批次，不同人员操作，其结果一致性强，适合大规模、高通量的样品分析，一次可处理样品几十个。

本发明具有以下意义：

1为猪瘟病毒的早期快速诊断提供有力的工具

应用荧光定量PCR技术取代传统的细胞培养法成为检测猪瘟病毒的最理想的标准,为猪瘟病毒的早期快速诊断提供有力的工具。

2准确定量猪瘟兔化弱毒从而科学的合理比例配苗