[发明专利]应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法

权利要求书

1.应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法，其特征在于，采用Taqman探针法实时荧光定量PCR进行定量检测，上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示，Taqman荧光探针序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Taqman荧光探针序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记为TAMRA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的RNA核酸；

（2）配置定量PCR反应液；

（3）将待测样品的核酸加入步骤(2)配置的反应液中，制得到反应体系；

（4）配制标准品PCR反应液，将标准品按梯度稀释，每个稀释梯度液取液加入步骤(2)配置的反应液中，制得反应体系；

（5）将配置的反应液置于定量PCR仪中，运行定量PCR检测反应程序；

（6）扩增反应结束后，结合PCR所给出标准曲线计算待测样品中RNA模板拷贝数，并由此计算待测样品中猪瘟病毒具体含量。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）按照常规TRIZol试剂法提取待测样品的RNA核酸。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）和（4）所述的反应体系包括：PCR MIX12.5μL，10μm/L的上游引物0.5μL，10um/L的下游引物0.5μL，样品的核酸1μL，超纯水10.5μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）的标准品为RNA片段，序列如SEQ ID NO：4所示。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）将标准品按10倍的梯度稀释，依次含有标准品RNA拷贝数为10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（5）所述的定量PCR检测反应程序包括：42℃反转录30min，95℃预变性3min；94℃变性10s，65℃退火及延伸15s，45个循环。